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.2019年9月6日17:578-589。
doi:10.1016/j.omtn.2019.05.014。 Epub 2019年6月4日。

沉默MEKK2/MEKK3通路通过Hedgehog通路和JNK通路保护脊髓免受损伤

阎龙岗 1, 王一飞 2, 朱忠生 2, 郑伟登 三, 陈静（音译） 三, 董张（音译） 2, 姜群华 4, 赵世昌 5, 张亚东 6
附属公司

沉默MEKK2/MEKK3通路通过Hedgehog通路和JNK通路保护脊髓免受损伤

阎龙岗等。 摩尔热核酸. .

缩回

摘要

脊髓损伤（SCI）是一种严重的疾病，常伴有运动和感觉功能障碍。Hedgehog（Hh）通路在脊髓损伤后的病理损伤中具有保护作用。然而，具体机制尚不清楚。本研究旨在证实有丝分裂原活化蛋白激酶激酶-2（MEKK2）/MEKK3/JNK/Hh通路对脊髓损伤的影响。建立SCI大鼠模型，然后接种过表达MEKK2/MEKK3的质粒或小干扰RNA（siRNA）对抗MEKK2/MEKK3。在背根神经节（DRG）细胞中检测到MEKK2和-3的表达。测量后肢运动功能、c-Jun N末端激酶（JNK）和Hh-pathway相关基因的表达、神经丝-200（NF-200）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的水平。MEKK2和-3在DRG细胞中高水平表达。大鼠MEKK2/MEKK3的沉默导致胶质瘤相关癌基因同源物-1（Gli-1）、Nestin、Smo和Sonic Hedgehog（Shh）的表达增加。Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分和NF-200蛋白水平也增加。然而，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）、MIP-3α、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun的表达及GFAP水平降低。下调MEKK2/MEKK3通过激活Hh通路和干扰JNK通路促进神经前体细胞分化，从而改善SCI症状。本研究的结果揭示了SCI治疗的潜在生物标志物。

关键词：刺猬信号通路；JNK信号通路；MEKK2/MEKK3；神经祖细胞分化；脊髓损伤。

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数字

图1
图1
Western Blot分析显示MEKK2和-3在DRG细胞中的表达增加（A）；（B） MEKK2蛋白水平；和（C）MEKK3的蛋白质水平*与正常对照组相比p<0.05；n=3。数据表示为平均值±SD，并通过单向方差分析进行比较。实验重复了三次。
图2
图2
BBB评分和H&E染色证实成功建立了SCI大鼠模型（A），手术后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天大鼠后肢的运动功能根据BBB评分进行评估。（B） H&E染色检测术后第0、7、14、21和28天大鼠脊髓组织病理学变化（×400）。（C和D）术后第28天大鼠脊髓组织中GFAP（C）和NF-200（D）的阳性水平，采用免疫组织化学方法进行评估（×400）*与正常组相比p<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。（A）中的数据通过重复测量方差分析进行比较，（B）–（D）中的结果通过非配对t检验进行比较；n=10。
图3
图3
通过qRT-PCR测定，Hh通路的抑制在术后第28天阻止假损伤组和SCI组中Gli-1、Nestin、Smo和Shh的SCI恢复（A）mRNA表达。（B） 通过western blot分析测定术后第28天假损伤组和SCI组的Gli-1、Nestin、Smo和Shh蛋白水平。（C） 术后第28天各组Gli-1、Nestin、Smo和Shh的mRNA表达通过qRT-PCR测定。（D） 术后第28天，各组的Gli-1、Nestin、Smo和Shh蛋白水平通过western blot分析测定。（E） 各组大鼠转导后第0、7、14、21和28天的后肢运动功能，采用BBB量表进行评估。（F） H&E染色检测转导后第0、7、14、21和28天各组脊髓组织的组织病理学变化（×100）。（G） 转导后第28天，各组NF-200和GFAP的阳性水平通过免疫组织化学测定（×400）*与假损伤/SCI+DMSO组相比，p<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。（E）中的数据通过重复测量方差分析进行比较，而其他面板中的数据则通过非配对t检验进行比较；n=10。
图4
图4
通过qRT-PCR测定，JNK通路的阻断对假损伤组和SCI组术后第28天MCP-1、MIP-1β和MIP-3α的SCI（A）mRNA表达具有保护作用。（B） western blot分析检测假伤组和SCI组术后第28天p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun蛋白水平。（C） qRT-PCR检测术后第28天各组MCP-1、MIP-1β和MIP-3αmRNA的表达。（D） western blot分析检测术后第28天各组p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun蛋白水平。（E） 转导后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天各组大鼠后肢的运动功能通过BBB评分进行评估。（F） H&E染色检测转导后第28天各组脊髓组织的组织病理学变化（×100）。（G） 转导后第28天各组NF-200和GFAP蛋白的阳性水平通过免疫组织化学（×400）测定*与sham/SCI+DMSO组相比，p<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。（E）中的数据通过重复测量方差分析进行比较，而其他面板中的数据则通过非配对t检验进行比较；n=10。
图5
图5
过度表达的MEKK2/MEKK3通过抑制Hh通路和激活JNK通路加重SCI（A）通过western blot分析确定的MEK02/MEKK3载体的转导效率。（B） 术后第28天，用qRT-PCR检测各组Hh-和JNK-通路相关因子的mRNA表达。（C） 术后第28天各组Hh-pathway相关因子的蛋白水平，通过western blot分析测定。（D） 在手术后第28天，使用蛋白质印迹分析检测各组中JNK通路相关因子的蛋白质水平。（E） 转导后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天，各组大鼠的后肢运动功能按照BBB量表进行测试。（F） 转导后第28天各组脊髓组织的组织病理学变化，用H&E染色观察（×100）。（G） 转导后第28天各组NF-200和GFAP蛋白的阳性水平，用免疫组织化学法测定（×400）*与SCI+NC-vector组相比，p<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。（E）中的数据通过重复测量方差分析进行比较，而其他面板中的数据则通过单向方差分析进行对比；n=10。
图6
图6
MEKK2/MEKK3干扰通过激活Hh通路和抑制JNK通路缓解SCI（A）通过western blot分析测定si-MEK2/MEKK3的转导效率。（B） 转导后第28天各组Hh-和JNK通路相关因子的mRNA表达，通过qRT-PCR进行评估。（C） 转导后第28天各组Hh通路相关因子的蛋白水平，通过western blot分析测定。（D） 转导后第28天各组JNK通路相关因子的蛋白水平，通过western blot分析测定。（E） 转导后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天，各组大鼠的后肢运动功能按照BBB量表进行评估。（F） 转导后第28天各组大鼠脊髓组织病理学变化，根据H&E染色（×400）。（G） 转导后第28天各组NF-200和GFAP蛋白的阳性水平，用免疫组织化学法测定（×400）*与SCI+si-NC组相比p<0.05；#与SCI+si-MEKK2/MEKK3+DMSO组相比，p＜0.05。数据表示为平均值±标准偏差。（E）中的数据通过重复测量方差分析进行比较，而其他面板中的数据则通过单向方差分析进行对比；n=10。
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