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.2020年3月；27(3):984-998.
doi:10.1038/s41418-019-0392-8。 Epub 2019年7月31日。

CSNAP是最小的CSN亚单位，通过cullin-RING泛素连接酶调节蛋白质平衡

玛丽亚·费泽西·李维 1, 艾丽特·费纳 1, 拉多斯拉夫·伊万诺夫·恩切夫 2 3, 吉利·本·尼桑 1, 伊莎·莱文 4, 梅塔尔·库维瓦泽 4, 吉尔吉·弗里德兰德 5, Tomer Meir沙拉 6, 雷纳特·尼沃 1, 马提亚斯·彼得 2, 米查尔·沙龙 7
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CSNAP是最小的CSN亚单位，通过cullin-RING泛素连接酶调节蛋白质平衡

玛丽亚·Güzesi-Levi等。 细胞死亡不同. 2020年3月.

摘要

cullin-RING泛素E3连接酶（CRL）家族由约250个复合物组成，可催化蛋白质泛素化以实现细胞调节。COP9信号体复合物（CSN）通过酶（去甲酰化）和非酶（空间位阻）机制抑制所有CRL。这两种机制的相对贡献尚不清楚。在这里，我们使用最近发现的CSN第九亚单位CSNAP来解耦机制。我们发现CSNAP降低了CSN对CRL复合物的亲和力。去除CSNAP不会影响去甲酰化，但会对CRL产生全局影响，导致生殖能力改变，抑制DNA损伤反应，并延迟细胞周期进展。因此，尽管CSNAP仅占CSN质量的2%，但它在CSN对CRL的空间调控中起着关键作用。

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数字

图1
图1
CSNAP修改CSN-CRL相互作用的强度。一CSN催化活性不受CSNAP的影响。WT和ΔCSNAP细胞提取物的代表性western blot使用针对各种cullins的抗体进行可视化（顶部），以及显示平均去甲酰化部分的图。该图表示三个独立实验的平均值，带有标准误差。b条使用来自WT和ΔCSNAP细胞的CSN3抗体将CSN及其相互作用蛋白拉下。然后使用三个生物重复，通过无标记蛋白质组学方法分析免疫沉淀的蛋白质。散点图比较日志2ΔCSNAP和WT样品中的蛋白质强度表明，在CSN和CSN的下拉过程中，发现许多CRL蛋白的表达过高或过低ΔCSNAP复合物。相反，CSN亚单位的平均强度比没有超过ΔCSNAP/WT的倍数变化 > 1.5，这被认为是褶皱变化的截止点。c（c）验证FBXL15/CSN和DDB2/CSN相互作用的蛋白质组学数据。在没有CSNAP的情况下，交互免疫沉淀显示CSN3与FBXL15和DDB2的相互作用更紧密。免疫沉淀蛋白用相关抗体进行免疫印迹检测。三个独立实验的密度分析如图S1a所示。d日验证Cul5/CSN相互作用的蛋白质组学数据。在没有CSNAP或其C末端相互作用域的情况下，使用抗CSN3的免疫沉淀显示出更强的相互作用，而在ΔCSNAP细胞中全长CSNAP的过度表达可以挽救WT细胞特有的较弱的Cul5/CSN相互作用。由于缺乏适当的抗体，无法进行双向免疫沉淀。密度分析显示，三个独立实验的Cul5平均强度归一化为WT，标准误差为，显著性使用双向方差分析计算处理和批次(第页 = 0.000469），然后进行Tukey的事后测试。e（电子）WT和ΔCSNAP细胞中CSN亚单位的水平是可比较的（30 μg总蛋白负载）；因此，下拉蛋白数量的差异可能是由于不同的相互作用亲和力造成的。三次重复中的代表性斑点。（f）离解常数的测定(K（K）d日)对于CSN和CSNΔCSNAP复合物和丹酰标记的Cul1-Nedd8/Rbx1。CSNAP的缺失导致与cullin1/Rbx1的绑定更紧密
图2
图2
CSNAP的缺失会损害细胞周期进展和生存能力。一在稳定的重同位素和轻同位素标记的ΔCSNAP和WT细胞中监测蛋白质泛素化。条形图显示了四分之三的独立实验中出现的差异泛素化（向上或向下）蛋白质的数量。总共鉴定出1563种具有单个或多个泛素化位点的蛋白质。b条,c（c）ΔCSNAP和WT细胞中差异泛素化蛋白质的通路分析（使用Reactome 2016）表明，多组蛋白质富集。每个条形图左侧的数字表示被富集的蛋白质数量和–log10（调整后的p值）y轴反映了与注释基因集重叠的概率（表S5A、B显示了每个注释组中重叠基因/基因数量的比率）。d日验证缺乏CSNAP对细胞周期的影响。BrdU和碘化丙啶染色的异步细胞的直方图显示，CSNAP的缺乏导致S-G2表型的改变。CSNAP-Cerulean的表达可以挽救S期人群的百分比，但当其C末端CSN相互作用域缺失时则不能。图中显示了一个具有代表性的实验（每个收集了50000个细胞），条形图显示了四个细胞群的分布（ΔCSNAP + ΔC-CSNAP-Cr和ΔCSNAP + CSNAP-Cer），或十个重复（WT和ΔCSNAP）。使用单因素方差分析（S期）计算显著性水平第页 = 0.0102，G0/G1相第页 = 2.8e−07），然后进行Tukey的事后测试。e（电子）与WT细胞相比，ΔCSNAP细胞含有更多的死亡细胞（早期和晚期凋亡）。条形图显示了单个细胞的平均百分比 ± 标准误差，使用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色通过流式细胞术测量。使用配对学生的t吨-测试，使用14个重复。（提前 + 晚期凋亡：第页 = 0.0028).（f）缺乏CSNAP的细胞比WT细胞具有更低的集落形成潜能。该图表示14个生物复制的结果，显著性使用配对的Student’st吨-测试(第页 = 0.00039). 上图显示了一个典型的实验
图3
图3
CSNAP的缺失会影响紫外线损伤后的蛋白质组重构。一未经处理或紫外线照射的WT和ΔCSNAP细胞的蛋白质组4 h后损伤采用无标记蛋白质组学方法进行分析。利用菌株和紫外线处理这两个因素及其相互作用，通过双向方差分析（ANOVA）对三个生物复制品的蛋白质组学数据进行对数转换和铺地分析。具有第页-低于0.05的值和高于1.5的绝对折叠变化被认为是差异表达。差异表达蛋白的热图分为五个簇。簇的通路分析表明ΔCSNAP细胞中几种细胞功能的上调和下调。左边的条形图表示了使用人类基因组的蛋白质编码部分对蛋白质进行富集分析的显著性水平。b条未处理和紫外线暴露的WT和ΔCSNAP细胞中蛋白质组中差异表达蛋白质的比较。条形图显示了四个成对比较中的每一个，强调了在ΔCSNAP细胞中，DNA损伤反应受到损害。c（c）通过WT和ΔCSNAP细胞裂解物的western blots分析四种代表性蛋白质的表达水平：PARP1、NQO1、PDCD4和波形蛋白。对紫外线处理的样品进行测试2 h后损坏
图4
图4
暴露于紫外线照射后的恢复受CSNAP缺乏的影响。一ΔCSNAP细胞的DNA损伤反应减弱。γH2AX Ser139磷酸化的剂量依赖性诱导分析。Western blots检测1.5 h后损坏。五个实验的代表性结果表明ΔCSNAP细胞中γH2AX Ser139磷酸化降低。b条与WT细胞不同，紫外线照射后受损的DNA在ΔCSNAP细胞中积累。用碱性彗星试验测定紫外线的遗传毒性。以橄榄尾矩表示的DNA损伤被计算出来，并呈现为一个盒子-嘶嘶作图。在每个生物复制中，橄榄尾力矩的比例大于 计算3。使用双向方差分析比较ΔCSNAP和WT样品中的比例，说明组和批次（紫外线处理样品第页 = 0.00142). 数据显示在紫外线处理前后（每个重复6次）。c（c）紫外线照射前后WT和ΔCSNAP细胞代谢活性的比较。该图显示了紫外线诱导DNA损伤前后WT和ΔCSNAP细胞的代谢活动，26和28 h（2和4 接种后的h），计算为每个细胞系初始活性的倍数。WT和ΔCSNAP细胞的代谢活性随着DNA损伤而降低，但检测到活性降低的差异，对于表达全长CSNAP-Crelean的WT细胞或ΔCSNAP细胞，观察到明显的代谢降低程度。该图表示三个独立实验的平均值，带有标准误差。使用双向方差分析测试计算治疗、时间、细胞类型和批次的显著性（治疗效果：第页 < 2e−16，时间效应：第页 = 0.07905，细胞类型的影响：第页 = 1.27e−08），仅对处理过的样品进行另一个方差分析，然后进行Tukey的细胞类型事后检验。d日紫外线照射的ΔCSNAP细胞在S期和G2期停留时间更长。根据紫外线照射后双胸腺嘧啶同步化细胞的流式细胞术直方图计算，比较细胞周期不同阶段细胞群的相对分布（5 焦耳/米2). 紫外线诱导的DNA损伤导致缺乏CSNAP细胞的细胞周期延长。图表显示了三个实验中的一个具有代表性的实验。e（电子）缺乏CSNAP的细胞在暴露于高剂量紫外线后表现出受损的恢复。WT和ΔCSNAP细胞在培养条件下培养8天之前接受紫外线照射。菌落被染色并计数。与WT细胞相比，ΔCSNAP细胞在紫外线损伤后表现出约2.7倍的集落形成潜能。该图表示七个生物重复的平均结果，并带有标准误差。使用配对Student’s计算显著性t吨-测试(第页 = 0.035).（f）紫外线损伤后，ΔCSNAP细胞的早期凋亡反应延迟。条形图表示每个时间点三个独立的流式细胞术实验检测到的活细胞、早期和晚期凋亡细胞的平均百分比 ± 标准错误。WT和ΔCSNAP细胞在4 紫外线照射h，使用双向方差分析计算，考虑治疗和批次（治疗对早期凋亡的影响第页 = 0.00506），然后进行Tukey的事后测试。在缺乏CSNAP的细胞中过度表达CSNAP-Cerulean可以挽救迟发性凋亡，但当其C末端相互作用域缺失时则不能。紫外线照射8小时后，WT和ΔCSNAP细胞中凋亡细胞的分布相似。克缺乏CSNAP的细胞PARP1分裂延迟。染色质结合组分通过western blot监测caspase介导的PARP1裂解，这是细胞凋亡的标志。小时CSN公司ΔCSNAP与CSN复合物相比，显示出对DDB2的亲和力增加。将WT和ΔCSNAP细胞暴露于紫外线照射下，在紫外线损伤后的不同时间点从染色质结合部分免疫沉淀DDB2。Western blot分析显示当CSNAP缺失时CSN-CRL结合更紧密。四个重复的代表性印迹
图5
图5
CSNAP影响CSN-CRL相互作用的强度。表示CRL循环的图。CRL与各种适配器和底物受体形成动态复合物。Nedd8与cullin亚基中保守的赖氨酸残基结合，诱导构象变化，激活CRL复合物，促进泛素转移到底物。CSN复合物通过催化和非催化两种独立机制使CRL组件失活。第一种方法涉及催化去除Nedd8共轭物，而第二种方法通过与CRL的物理结合进行调节，在空间上阻止与E2酶和泛素化底物的相互作用。随后，在CSN解离后，CRL可以被分解并组装成新的构型，或结合Cand1。这个循环可以根据细胞的需要使CRL适应，从而使特定底物泛素化。我们的结果表明，CSNAP降低了CSN对CRL的亲和力，从而使CRL复合物能够有效地分解和重塑。在没有CSNAP的情况下，循环的拆卸和组装步骤受到影响，如红色虚线所示，影响CRL组件的重新配置及其对细胞刺激的反应能力
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