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.2019年7月10日9:619。
doi:10.3389/fonc.2019.00619。 2019年电子采集。

MicroRNA-153通过靶向吲哚胺2,3-双加氧酶1降低膀胱癌的色氨酸分解代谢并抑制血管生成

张文涛 1 2, 毛世玉（Shiyu Mao） 1, 东汇市 三, 张俊峰 1, Ziwei Zhang（章子伟） 1, 郭亚东 1, 袁武 1 2, 王瑞良 1, 王龙生 1, 黄勇 4, 姚旭东 1 2
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MicroRNA-153通过靶向吲哚胺2,3-双加氧酶1降低膀胱癌的色氨酸分解代谢并抑制血管生成

张文涛等。 前Oncol. .

勘误表in

摘要

背景：转移是癌症死亡的主要原因，值得进一步研究。本研究评估了膀胱癌组织中microRNA-153（miR-153）的表达，并探讨了miR-153-介导膀胱癌细胞调控的潜在分子机制。方法：收集45例膀胱癌患者的配对组织标本进行qRT-PCR。使用癌症基因组图谱（TCGA）数据集确定miR-153与膀胱癌预后的关系。膀胱癌组织和永生化细胞系用于以下实验：miR-153模拟物和吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）siRNA转染；Western blot、细胞活力、菌落形成和Transwell分析；裸鼠异种移植；鸡胚绒毛尿囊膜血管生成（CAM）检测。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与膀胱癌细胞共培养用于试管形成分析。荧光素酶报告子分析用于确认miR-153靶基因。结果：miR-153在膀胱癌组织和细胞系中的表达下调，而miR-153的表达降低与肿瘤晚期和患者的总体生存率差有关。此外，miR-153的表达通过促进肿瘤细胞凋亡、迁移、侵袭和内皮间质转化（EMT）抑制膀胱癌细胞生长在体外和肿瘤异种移植生长体内miR-153表达抑制了HUVEC和CAM血管生成。在基因水平上，miR-153通过抑制IL6/STAT3/VEGF信号传导，靶向IDO1表达并抑制膀胱癌细胞色氨酸代谢。结论：总之，我们的数据表明miR-153通过靶向IDO1表达在膀胱癌中发挥抗肿瘤活性。未来的研究将研究miR-153作为膀胱癌患者的新治疗靶点。

关键词：3-双加氧酶1；血管生成；膀胱癌；吲哚胺2；miR-153；色氨酸分解代谢。

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数字

图1
图1
miR-153在膀胱癌组织和细胞系中下调。（A）qRT-PCR。应用qPCR技术在45对膀胱癌（肿瘤）及癌旁正常组织中检测到miR-153(P（P）< 0.05).（B）miR-153与临床病理特征的相关性。miR-153水平降低与晚期肿瘤T分期相关。（C）TCGA数据集中miR-153表达分层的Kaplan-Meier曲线和对数秩检验(http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/).（D）qRT-PCR。培养了多种膀胱癌细胞系（T24、UMUC3、J82、5637和EJ）和永生膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）并用于qPCR分析(*P（P）< 0.05).
图2
图2
miR-153抑制膀胱癌生长在体外和体内通过促进肿瘤细胞凋亡、迁移、侵袭和EMT。（A）细胞活力CCK-8测定。用miR-153模拟物或阴性对照转染T24和UMUC3细胞，然后进行CCK-8分析。（B）裸鼠异种移植试验。将稳定表达miR-153的模拟物或阴性对照膀胱癌细胞皮下注射到裸鼠体内，并监测40天肿瘤细胞异种移植的形成和生长。（C）肿瘤细胞异种移植生长曲线。（D）肿瘤细胞异种移植重量。（E）集落形成分析。用miR-153模拟物或阴性对照转染T24和UMUC3细胞，然后进行肿瘤细胞集落形成试验（x 200）。（F）蛋白质印迹。通过Western blot分析评估miR-153模拟物或阴性对照转染T24和UMUC3细胞中EMT相关标记的表达水平。（G）Transwell肿瘤细胞迁移分析。（H）Transwell肿瘤细胞侵袭试验。（一）流式细胞术Annexin V-PI双重染色分析*P（P）< 0.05.
图3
图3
miR-153抑制膀胱癌血管生成在体外和体内.（A）流式细胞术分析。与miR-153或阴性对照转染的T24和UMUC3细胞共培养后，用流式细胞术检测HVUEC上CD34的表达。（B）HUVEC试管形成分析。使用Transwells将HUVEC与T24和UMUC3细胞共同培养，然后进行毛细血管样管形成试验（x100）。（C）CAM血管生成分析。将miR-153或阴性对照转染的T24细胞加入CAM中诱导血管生成48小时，以诱导血管分支的形成（x 10）。（D）测量血管长度(*第页< 0.05).
图4
图4
IDO1是miR-153的直接靶点。（A）生物信息学分析预测IDO1是miR-153的直接靶点。（B）荧光素酶报告分析。将miR-153或miR-NC转染的膀胱癌细胞与荧光素酶报告质粒（WT或MUT 3-UTR IDO1 cDNA）共转染，然后进行蛋白质提取和荧光素酶报告分析。（C）qRT-PCR显示miR-153与癌组织中IDO1的表达呈负相关（D）qRT-PCR和Western blot。生长miR-153或阴性对照转染的T24和UMUC3细胞，并进行qRT-PCR和蛋白质印迹。（E）培养UHPLC-MS、miR-153或阴性对照转染的T24和UMUC3细胞，上清液经UHPLC-MS处理；色氨酸与犬尿氨酸比值的比较*P（P）< 0.05.
图5
图5
IDO1敲低可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡和EMT标志物的调节。（A）细胞活力CCK-8测定。用IDO1或阴性对照siRNA转染T24和UMUC3细胞，然后进行CCK-8分析。（B）集落形成分析。用IDO1或阴性对照siRNA转染T24和UMUC3细胞，然后进行集落形成（x200）和Transwell分析。（C）蛋白质印迹。用Western blot分析IDO1敲除后T24和UMUC3细胞中EMT相关标记物的水平。（D）Transwell迁移分析。（E）Transwell侵入试验。（E）敲除IDO1后T24和UMUC3细胞的流式细胞术Annexin V-PI双重染色分析*P（P）< 0.05.
图6
图6
IDO1敲除抑制血管生成。（A）流式细胞术分析。将HUVEC与IDO-siRNA或阴性对照siRNA转染的T24和UMUC3细胞共同培养，然后对HUVECs上的CD34水平进行流式细胞术分析。（B）HUVEC试管形成分析。对相同培养的HUVEC进行试管形成试验（x100）。（C、D）CAM分析。将siRNA-转染的T24细胞添加到CAM中，以调节48小时（x 10）的血管生成。测量树枝和长度(*第页< 0.05).
图7
图7
miR-153靶向IDO1并通过IL6/STAT3/VEGF信号调节血管生成。（A、B）ELISA法。使用ELISA分析T24和UMUC3细胞中IL_6的表达（miR-153的过度表达或IDO1的敲除及其各自的阴性对照）。（C、D）蛋白质印迹。用100 ng/ml的IL-6预处理T24和UMUC3细胞（miR-153的过度表达或IDO1的敲除及其各自的阴性对照）48 h，然后进行STAT3、p-STAT3和VEGF的Western blot分析。
图8
图8
膀胱癌细胞中miR-153基因通路的图示。miR-153在膀胱癌中表达缺失，从而降低IDO1的表达以及膀胱癌细胞中IL6/STAT3/VEGF信号通路的后续活性。
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