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.2019年7月23日;9(1):10611.
doi:10.1038/s41598-019-47027-5。

KDELR1基因敲除细胞系的转录组学揭示了调节的细胞粘附特性

附属公司

KDELR1基因敲除细胞系的转录组学揭示了调节的细胞粘附特性

安德里亚·布卢姆等。 科学代表. .

摘要

KDEL受体(KDELRs)代表分泌途径的跨膜蛋白,调节可溶性ER受体的滞留以及逆行和顺行小泡运输。此外,KDELR还参与细胞应激反应和ECM降解的调节。为了更深入地了解KDELR1的特定功能,我们通过比较KDELR1-KO细胞及其各自的HAP1野生型,通过全转录组分析对KDELR1-KO细胞系(HAP1)进行了表征。我们的数据表明,有300多个显著且差异表达的基因,其基因产物主要参与细胞粘附和ECM组成等发育过程,这表明KDELR1缺失会导致严重的细胞疾病。通过体外粘附试验进一步证明KDELR1-KO细胞的粘附能力受损,而胶原和/或层粘连蛋白涂层使KDELR1-GO细胞的粘附性能几乎比野生型增加了一倍,证实了转录适应可以改善或恢复细胞粘附能力。在内质网应激条件下,内质网驻留PDI的分泌增加和细胞活力下降证实了分泌途径中的扰动,这表明KDELR1-KO细胞在维持细胞稳态方面受到严重损害。

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图1
图1
确认HAP1细胞中的KDELR1-KO。()KDELR1-KO细胞(第三通道)和野生型(第四通道)基因组KDELR1 DNA序列的测序结果。KDELR1-KO细胞在HAP1细胞中显示KDELR1基因第一外显子内的“T16”缺失,导致外显子2(T188 G189 A190)过早终止密码(b条)野生型(WT)和KDELR1-KO(KO)HAP1细胞中KDELR1的mRNA水平。所示为聚-A富集RNA序列的TPM平均值(百万分之转录本)(标准偏差为三倍)。
图2
图2
KDELR1-KO影响HAP1细胞的转录组。()MA图表示野生型和KDELR1-KO样品之间的差异。(b条)显著丰富GO术语的可视化(调整后的p值 < 与HAP1野生型相比,KDELR1-KO细胞中存在0.01)。在REViGO中使用GO术语及其调整后的p值生成三个交互图(允许相似性:中等(0.7),数据库:智人,语义相似性度量:SimRel),显示在一个图像中。圆圈的大小表示基因集中各个GO项的频率。在GO分析中,使用了更强烈的灰色阴影以显示更高的重要性。相似的GO术语与线条相连,每条线条的宽度表明了相似程度。
图3
图3
KDELR1-KO细胞表现出更强的迁移/增殖能力,但在未涂层表面上的粘附性能受损,可以通过胶原或层粘连蛋白涂层来修复。()划痕法比较KDELR1-KO细胞与HAP1野生型细胞的迁移行为。时间点0的区域在24小时后测量并计算100%的划痕面积h和48在无FCS培养基中测量h培养时间,并将其作为6个重复的平均值以图表形式表示。误差条表示相应的标准偏差,统计显著性由学生t检验确定,显著性差异用星号标记(p < 0.05). 此外,进行了双向方差分析,确定了样本的显著差异(p = 0.047)和相互作用(p = 0.009). (b条)粘附试验,比较KDELR1-KO与HAP1野生型细胞在胶原蛋白涂层、层粘连蛋白涂层或未涂层96层钢板中的粘附行为。用1清洗未结合的细胞×PBS公司。4之后h粘附时间,贴壁细胞用2%PFA固定,用1×PBS和结晶紫染色。在590℃时测量吸收在用无菌水洗涤5个步骤后。图表表示15次重复的平均值和各自的标准偏差。统计学意义由学生t检验确定,显著性差异用三个星号标记(p < 0.01). 双向方差分析还表明样本之间存在显著差异(p < 0.01),条件(p < 0.01)和相互作用(p < 0.01).
图4
图4
KDELR1-KO细胞在内质网应激条件下,PDI分泌增加,细胞活力降低。()HAP1野生型(WT)和KDELR1-KO细胞中PDI的分泌。在每种情况下,针对PBS透析无细胞培养上清液,通过VivaSpin离心浓缩,并测定总蛋白量并进行均匀调整。对于两个样品,通过SDS-PAGE分离相同量的蛋白质,随后通过蛋白质印迹分析PDI信号强度。(b条)内质网应激条件下HAP1-WT和KDELR1-KO细胞的敏感性。用thapsigargin(Tg)处理细胞24小时h诱导内质网应激,通过MTT分析细胞活性。二甲基亚砜对照样品中的存活率计算为100%,测定了经Tg处理的细胞的存活率,并在图中表示为20(1)的平均值µg/ml Tg)或10(1,5µg/ml Tg)与相应的标准偏差一起复制。统计学意义由学生t检验确定,显著性差异用三个星号标记(p < 0.01). 此外,进行了双向方差分析,结果表明样本之间存在显著差异(p < 0.01),条件(p < 0.01)和相互作用(p < 0.01).

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引用人

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