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.2019年7月5日13:297。
doi:10.3389/fnsel.2019.00297。 2019年eCollection。

停车场2突变导致人类iPSC-Derived神经元代谢紊乱和存活受损

海尔·博格托夫 1 2, 皮亚·延森 三, 马蒂亚斯·莱丁 1, Sissel I施密特 1, Justyna Okarmus公司 1, 路易斯·里特 1, 克里斯蒂娜·斯沃姆 1, 迈克拉·霍恩霍尔特 4, 卡拉·阿齐夫多 5, 劳伦特·罗伊本 5, Lasse K烘焙 4, 海尔·瓦格彼得森 4, 布伦特·J·瑞安 2, 理查德·韦德·马丁斯 2, 马丁·拉森 三, 莫滕·迈耶 1 6
附属公司

停车场2突变导致人类iPSC-Derived神经元代谢紊乱和存活受损

海尔·博格托夫等。 前细胞神经科学. .

摘要

蛋白parkin，由停车场2基因对线粒体内稳态至关重要，尽管它与帕金森氏病（PD）有关，但其发病机制仍不清楚。我们应用基于质谱的蛋白质组学研究帕金功能障碍对人类等基因诱导的多能干细胞源神经元线粒体蛋白质组的影响，包括有无帕金功能障碍停车场2击倒（KO）。蛋白质组学分析量化了近60%的线粒体蛋白，其中119种在患有停车场2让开。蛋白质变化表明氧化应激防御、线粒体呼吸和形态、细胞周期控制和细胞生存能力受到干扰。结构和功能分析显示线粒体面积增加，线粒体拉长，糖酵解和乳酸支持的呼吸受损，导致PARK2 KO神经元细胞存活受损。这为人类神经元帕金功能障碍的影响提供了有价值的见解，并提供了疾病相关通路的知识，这些通路可能成为治疗干预的目标。

关键词：帕金森氏病；代谢；线粒体；氧化应激；蛋白质组学；生存。

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数字

图1
图1
PARK2基因敲除（KO）诱导的多能干细胞（iPSC）衍生神经元线粒体变化的蛋白质组分析。（A、B）蛋白质印迹（A）parkin蛋白验证停车场2KO和（B）酪氨酸羟化酶（TH）显示类似的多巴胺能（DA）分化。（C）对照组和对照组的免疫荧光染色停车场2分化第25天KO神经元的TH（绿色）和微管相关蛋白2（MAP2，红色）阳性神经元的水平没有差异。比例尺=50μm。（D）免疫荧光染色法检测突触素（SYP）和β-Ⅲ-管蛋白（TUJ1）证实了成熟蛋白的存在停车场2KO和控制神经元。比例尺=25μm。（E）实验装置示意图：停车场2由锌指核酸酶（ZFNs）和等基因健康对照iPSC系产生的KO iPSC被分化为神经干细胞（NSCs），进而分化为DA神经元。对来自三个独立分化的细胞裂解液进行线粒体富集。在亲水相互作用液相色谱（HILIC）和纳米液相色谱-串联质谱分析（nLC-MSMS）之前，将蛋白质消化成肽，并以1:1:1:1:1:1的比例进行标记和混合。（F）已鉴定蛋白质概述：945个线粒体蛋白质由两个或多个肽鉴定，其中119个蛋白的水平在停车场2KO神经元。（G）分析确定了基因本体数据库（GO术语：线粒体，生物体：智人，类型：蛋白质）中列出的所有线粒体蛋白质的60%，其中7%在停车场2KO神经元。（H，I）蛋白质组学鉴定的平均丰度（对数比）（H）所有线粒体蛋白以及（一）神经元标记物TUJ1、MAP2和SYP在对照组和停车场2KO神经元。平均值±SEM，n个=3个独立的差异。
图2
图2
蛋白质组变化的聚类和通路分析停车场2KO神经元。（A）对蛋白质组学分析确定的119个明显失调的线粒体蛋白质进行STRING分析，发现三组蛋白质分别与乳酸-丙酮酸代谢（左组）、氧化应激（右组）和细胞周期调节和细胞死亡（下组）有关。仅显示连接的节点。线条厚度表示支持数据的强度。（B）通过对明显失调的线粒体蛋白质进行独创性途径分析（IPA）确定的顶级毒性相关途径。条形图表示每条路径的富集水平，如–log所示(P（P）-值）。相应的点表示所识别的蛋白质在该途径中的蛋白质总数中的比例。（C）Western blotting证实14-3-3水平显著下降𝜀 在里面停车场2KO神经元。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白，并与对照神经元相对。平均值±SEM，n个=3个技术复制，来自三个独立差异的数据。∗∗P（P）<0.01，学生的吨-测试。
图3
图3
通过蛋白质组分析确认氧化应激防御蛋白下调。（A）表列出了线粒体蛋白质组分析确定的与氧化应激防御相关的蛋白质，以及停车场2KO神经元与对照组比较；q个-值（FDR调整P（P）-值）和独特肽的数量，n个=3个独立的差异。（B、C）Western blotting证实（B）DJ-1和（C）超氧化物歧化酶1（SOD1）停车场2KO神经元。表达水平归一化为β-肌动蛋白，并与对照神经元相对。平均值±SEM，n个=6个技术复制，来自三个独立差异的数据。∗P（P）<0.05，学生的吨-测试。
图4
图4
线粒体形态受干扰停车场2KO神经元。（A）TOM20（红色）免疫荧光染色和（B、C）量化控制和停车场2KO神经元显示（B）TOM20+对象数量不变（C）当归一化为DAPI+细胞核数量（蓝色）时，TOM20染色面积显著增加。（D）细长线粒体的数量在停车场2KO细胞，而圆形线粒体的数量不变，当根据大小（小与大）和形状（圆形与细长）分离TOM20+物体时。比例尺=10μm。平均值±SEM，n个=11–12个技术复制，来自四个独立差异的数据。（E）TOM20和VDAC1的平均蛋白质组鉴定丰度（对数比）在对照组和停车场2KO神经元。平均值±SEM，n个=3个独立的差异。（F，G）Western blotting显示（F）TOM20和（G）VDAC1级别。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白，并与对照神经元相对。平均值±SEM，n个=4–10个技术复制，来自三个独立差异的数据。（H）表列出了通过线粒体蛋白质组分析确定的与线粒体动力学相关的蛋白质，以及停车场2KO神经元与对照组比较；q个-值（FDR调整P（P）-值）和独特肽的数量，n个=3个独立的差异。（I，J）Western blotting显示（一）MIEF1和（J）COXIV英寸停车场2KO神经元。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白，并与对照神经元相对。平均值±SEM，n个=3-4个技术复制，数据来自三个独立的差异。∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,***P（P）<0.005，学生的吨-测试。
图5
图5
乳酸代谢的功能变化停车场2KO神经元支持蛋白质组分析显示的蛋白质变化。（A）表中列出了通过蛋白质组学分析鉴定的与乳酸-丙酮酸代谢相关的线粒体蛋白质，蛋白质水平的比例为停车场2KO神经元与对照组比较；q个-值（FDR调整P（P）-值）和独特肽的数量，n个=3个独立的差异。（B）Western blotting证实停车场2KO神经元。表达水平被标准化为β-肌动蛋白，并相对于对照神经元显示。平均值±SEM，n个=6个技术复制，来自三个独立差异的数据。（C–F）氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）停车场2KO和对照神经元归一化为蛋白质含量，说明基础呼吸、寡霉素治疗后与线粒体ATP生成相关的呼吸、FCCP治疗后的最大呼吸以及鱼藤酮/抗霉素治疗之后的非线粒体呼吸。剩余呼吸活动被定义为基线和FCCP诱导的最大呼吸之间的差异。（C） 停车场2KO神经元在含有2.5 mM葡萄糖和（D）在含有2.5 mM乳酸的培养基中，基础呼吸和ATP生成显著降低。（E、F）基础ECAR在停车场2KO神经元。平均值±SEM，n个=3–9个技术复制，来自三个独立差异的数据。∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）<0.01，学生的吨-测试。
图6
图6
细胞增殖和存活受阻停车场2KO神经元。（A）差异表达蛋白质的通路分析，用条形图显示富集分数–log 10(P（P）-值），并用颜色标记属于每个途径的已识别蛋白质的数量。只显示了含有两种或两种以上蛋白质的途径。（B）NSC阶段分化第0天、第5天、第10天和第25天的细胞计数表明，从第0-5天和第5-10天开始，细胞数量的倍数变化在停车场2与同基因对照相比，KO细胞，而从第10天到第25天，各系之间没有这种差异。平均值±SEM，n个=5–10个独立差异。（C、E）分化第0天Ki67+（红色）细胞的免疫荧光染色定量显示，细胞增殖水平显著降低停车场2KO文化。（D、F）在分化第25天，Ki67+细胞的相对含量在停车场2KO和控制神经元。平均值±SEM，N个=2个独立的差异。（G、H）对照组和对照组Annexin V（红色）的免疫荧光染色停车场2分化第0天和第25天的KO细胞在两种细胞系中均发现极少凋亡细胞。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺=50μm。（一）在分化第0、5、10和25天，通过悬浮液中细胞的台盼蓝染色测量的细胞活力显示停车场2第25天KO神经元。平均值±SEM，N个=4个独立的差异。（J）LDH释放到培养基中的量增加停车场2第25天KO培养与等基因对照组进行比较。与平均控制相关的数据。平均值±SEM，n个=3个独立的差异。（K，L）分化第25天、第35天和第45天的核形态分析表明，每个视野中碎裂核和固缩核占总细胞的比例。平均值±SEM，N个=15–36个视场，来自两个独立差异的数据。∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,***P（P）<0.001，学生吨-测试。
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