Splicing repression is a major function of TDP-43 in motor neurons

doi:10.1007/s00401-019-02042-8

.2019年11月；138(5):813-826.

doi:10.1007/s00401-019-02042-8。 Epub 2019年7月22日。

剪接阻遏是TDP-43在运动神经元中的主要功能

附属公司

¹约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。
²约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。
^三约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。lchen99@jhmi.edu。
⁴约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。wong@jhmi.edu。
⁵约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。wong@jhmi.edu。

PMID： 31332509
预防性维修识别码： PMC6802294型
内政部： 10.1007/s00401-019-02042-8

剪接阻遏是TDP-43在运动神经元中的主要功能

阿内什·唐德等。神经病理学学报. 2019年11月.

.2019年11月；138(5):813-826.

doi:10.1007/s00401-019-02042-8。 Epub 2019年7月22日。

附属公司

¹约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。
²约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。
^三约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。lchen99@jhmi.edu。
⁴约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。wong@jhmi.edu。
⁵约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205-2196，美国。wong@jhmi.edu。

PMID： 31332509
预防性维修识别码： PMC6802294型
内政部： 2007年10月10日/04001-019-02042-8

摘要

一种重要的RNA结合蛋白TDP-43的核耗竭可能是肌萎缩侧索硬化症（ALS）神经变性的基础。由于该蛋白具有多种功能，TDP-43在运动神经元中的关键作用尚不清楚，可能在ALS中受损。我们在这里表明，TDP-43介导的剪接抑制是运动神经元生理学的核心，它通过阻止异常剪接来保护转录组。嵌合阻遏物在果蝇TDP-43敲除模型中的表达，包括TDP-43的RNA识别结构域与不相关的剪接阻遏物RAVER1融合，减轻了运动缺陷并延长了寿命。同样，AAV9介导的向运动神经元中缺乏TDP-43的小鼠递送这种嵌合救援阻遏物延迟了运动症状的发生，减缓了运动症状进展，并显著延长了它们的寿命。在运动神经元中缺乏TDP-43的治疗小鼠中，异常剪接显著减少，并伴有轴突变性和运动神经元丢失的改善。这种AAV9策略允许嵌合阻遏物的长期表达而无任何不利影响。我们的发现确立了剪接抑制是TDP-43在运动神经元中的主要功能，并强烈支持TDP-43介导的剪接保真度丢失是ALS运动神经元丢失的关键致病机制的观点。

关键词：肌萎缩侧索硬化；隐秘外显子；果蝇；运动神经元；小鼠；TDP-43。

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作者声明没有竞争利益。

数字

**图1。**
TBPH缺乏苍蝇的隐秘外显子掺入。位于代表基因中的隐秘外显子（箭头）的可视化（红色条）。基因注释如下所示，标记外显子（厚）和内含子（虚线）。隐秘外显子可能有标准的5'和3'剪接位点[*rg公司*,**（a）**和*Pkc53E页*,**（b）**]也可能是外显子延伸[*CG42450型*,**（c）**]，5'未翻译区域[*七（sev）*,**（d）**]，聚腺苷化位点[*CG8405型*,**（e）**]或炎症插入**（f）**].（g）正如预测的[34]，隐秘外显子的两侧是上游、下游或内部存在的UG串联重复序列。

**图2。**
TBPH缺乏果蝇中CTR的表达。**（a）**的示意图*UAS-CTR系统*和*UAS-NTDP公司*嵌合结构。表达CTR融合蛋白而非NTDP可显著改善机车功能**（b），**延长使用寿命**（c），**突触波顿增加**（d）**和**（e）**抑制包括标准盒在内的各种隐秘外显子(*rg公司*)，5'未翻译区域(*七（sev）*)，转录起始位点(戴布)和外显子延伸(同步)纯合子*TBPHΔ23*背景为空。（**p<0.01，**p<0.001）。

**图3。**
CTR在中的表达*Tardbp公司*击倒老鼠。**（a）**的示意图*ChAT-IRES-核心*和*迟缓的^前/后*我们条件反射中的等位基因*Tardbp公司*击倒老鼠。Cre介导的外显子3的切除导致mRNA转录物的非传感介导的衰变。**（b）**p30 ChAT（红色）和CTR（由人类特异性N末端TDP-43抗体识别，绿色）在*ChAT-IRES-Cre；Tardbp公司^F类/+*和*ChAT-IRES-Cre；迟缓的^前/后*老鼠。在此早期，在运动神经元丧失之前，基因型之间的CTR转导效率没有观察到差异（转导效率的平均差异=2±5.5%，p=0.76，N=每个基因型5只动物，每个区域5只颈椎和腰椎切片）**（c）**脑内ChAT阳性神经元核CTR的定量研究*ChAT-IRES-Cre；迟缓的^F类/+*小鼠颈部（绿色）、腰部（红色）和背角神经元（蓝色）。我们的方案允许靶向运动神经元的效率达到60%，直到至少8个月，在颈椎和腰椎区域之间没有观察到差异。（N=每一时间点3只动物，每只动物每一区域5个脊髓切片，比例尺：100μm）。**（d）**AAV9中包装的CTR嵌合蛋白结构体示意图，带有人类TDP-43的N末端片段（橙色）、RAVER1的剪接阻遏结构域（蓝色）和人类TDP-33的3'非翻译区（3'UTR）。

**图4。**
CTR在中的表达*Tardbp公司*敲除小鼠延长生存期并减轻行为缺陷。**（a）**Kaplan-Meier生存曲线*ChAT-IRES-Cre；Tardbp公司^F类/+*和*ChAT-IRES-Cre；迟缓的^前/后*给予含有CTR（治疗）或GFP对照（未治疗）的AAV9的小鼠。两组数据一起显示。未经处理的中值*ChAT-IRES-Cre；迟缓的^前/后*治疗组小鼠的生存期从44周延长到73周（所有分析均p<0.001）。**（b）**CTR治疗减轻了基因敲除小鼠的年龄依赖性体重减轻，而对对照小鼠没有影响。悬挂钢丝**（c）**和旋转木马性能**（d）**与未经治疗的对照组相比，经CTR治疗的敲除小鼠的运动障碍得到缓解（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。Tukey的多重比较测试）。在CTR治疗的小鼠中，悬挂钢丝缺陷的进展也显著减弱（未经治疗的斜率=−1.19，CTR斜率=–0.68，p<0.01）**（e）**运动功能障碍发病的Kaplan-Meier生存曲线，定义为连续两周<60秒的挂线时间。CTR治疗敲除小鼠的发病延迟（中位发病时间：30周vs 19周，p<0.001）。

**图5。**
CTR在中的表达*Tardbp公司*敲除小鼠减弱运动神经元的丢失并恢复剪接抑制。**（a）**3个月大时L3腰腹角切片的代表性ChAT免疫染色。（比例尺：100μm）。**（b）**三个月龄CTR治疗（蓝色）和未治疗（红色）基因敲除小鼠ChAT阳性运动神经元的定量。由于CTR治疗和未治疗之间没有观察到差异*ChAT IRES Cre公司；Tardbp公司^F类/+*结果显示为各组各自对照组的百分比。未经治疗的敲除小鼠在p90时运动神经元数量减少了50%，而经CTR治疗的敲除了小鼠的运动神经元丰度为对照组的63%（腰部）和61%（颈部）（*p<0.05）。在我们观察到的60%的转导效率下，CTR对运动神经元死亡的完全细胞自主救援仍然只能导致约80%的运动神经元救援（虚线）。**（c、d）**代表性甲酚紫染色的L3根背侧和腹侧切片以及横截面积的量化。未经治疗的患者的腹侧而非背侧根区缩小*ChAT IRES Cre公司；迟缓的^前/后*小鼠，通过CTR治疗恢复（比例尺：200μm）。**（e）**预测p45小鼠TDP-43缺陷运动神经元中包含的隐匿外显子mRNA目标的相对水平，根据定量RT-PCR测定的GAPDH和TBP基因的平均值进行标准化。在CTR治疗的所有三个受试靶点中观察到隐匿外显子掺入减少*ChAT-IRES-Cre；迟缓的^前/后*小鼠，表明剪接抑制的部分恢复（*p＜0.05）。

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[1] Alami NH、Smith RB、Carrasco MA、Williams LA、Winbom CS、Han SSW、Kiskinis E、Winbon B、Freibaum BD、Kanagaraj A等（2014）。ALS引起突变会损害TDP-43 mRNA颗粒的轴转运。神经元81:536–543 Doi 10.1016/j.Neuron.2013.12.018-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Becker LA、Huang B、Bieri G、Ma R、Knowles DA、Jafar Nejad P、Messing J、Kim HJ、Soriano A、Auburger G等人（2017）治疗性减少共济失调蛋白2延长了TDP-43小鼠的寿命并减少了病理。自然544:367–371 Doi 10.1038/nature22038-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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