Dihydroxyacetone Exposure Alters NAD(P)H and Induces Mitochondrial Stress and Autophagy in HEK293T Cells

doi:10.1021/acs.chemrestox.9b00230

.2019年8月19日；32(8):1722-1731.

doi:10.1021/acs.chemrestox.9b00230。 Epub 2019年8月2日。

二羟基丙酮暴露改变HEK293T细胞NAD（P）H并诱导线粒体应激和自噬

凯利·史密斯^1 2, 费萨尔·海亚特^三 2, 乔尔·安德鲁斯^三 2, 玛丽·E·米高^三 2, 纳塔莉·加斯曼^1 2

附属公司

¹美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学医学院生理学和细胞生物学系，邮编36688。
²米切尔癌症研究所，南阿拉巴马大学，1660 Springhill Avenue，Mobile，Alabama 36604-1405，United States。
^三美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学医学院药理学系，邮编36688。

PMID： 31328504
预防性维修识别码： PMC6701868
内政部： 10.1021/acs.chemrestox.9b00230

二羟基丙酮暴露改变HEK293T细胞NAD（P）H并诱导线粒体应激和自噬

凯利·史密斯等。化学研究毒物. 2019.

.2019年8月19日；32(8):1722-1731.

doi:10.1021/acs.chemrestox.9b00230。 Epub 2019年8月2日。

作者

凯利·史密斯^1 2, 费萨尔·海亚特^三 2, 乔尔·安德鲁斯^三 2, 玛丽·E·米高^三 2, 娜塔莉·加斯曼^1 2

附属公司

¹南阿拉巴马大学医学院生理学和细胞生物学系，美国阿拉巴马州莫比尔36688。
²米切尔癌症研究所，南阿拉巴马大学，1660 Springhill Avenue，Mobile，Alabama 36604-1405，United States。
^三美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学医学院药理学系，邮编36688。

PMID： 31328504
预防性维修识别码：第6701868页
内政部： 10.1021/acs.chemrestox.9b00230

摘要

磷酸二羟基丙酮（DHAP）是果糖代谢的内源性副产物。细胞内过量的DHAP可诱导晚期糖基化终产物和氧化应激。二羟基丙酮（DHA）是DHAP的三糖前体。DHA被用作无阳光鞣制产品的活性成分，包括雾化喷雾鞣剂，它是由电子烟中的溶剂燃烧而成的。随着无阳光晒黑产品和电子烟的普及，人类对DHA的接触也在增加。局部施用的DHA通过皮肤的活性层吸收并进入血液。外源性接触DHA对永生化角质形成细胞和黑色素瘤细胞具有细胞毒性，细胞周期在24小时内被诱导停滞，72小时内由于与消费者相关的DHA浓度下的细胞凋亡而导致细胞死亡。关于皮肤吸收DHA后发生的全身性接触，目前知之甚少，现在通过吸入喷雾鞣制中使用的雾化DHA。在本研究中，HEK293T细胞暴露于与消费者相关的DHA浓度，以检测全身暴露的细胞毒性。HEK293T细胞对与消费者相关的DHA剂量和IC敏感₅₀值为2.4±0.3 mM。然而，细胞周期阻滞直到DHA暴露后48小时才开始。DHA暴露的细胞表现出代谢活性的改变，线粒体功能下降，乳酸和ATP生成量在暴露后24小时内下降。自动荧光成像和NAD⁺传感器还显示氧化还原辅因子NAD失衡⁺/NADH暴露24小时内。细胞死亡是由LC3B和SIRT1增加所指示的自噬引起的。尽管DHA能够转化为DHAP并融入代谢途径，但在HEK293T细胞中观察到的代谢功能障碍和饥饿反应表明，DHA并不容易促进这些细胞中的能量库。

PubMed免责声明

数字

**图1。DHA对HEK 293T细胞具有细胞毒性。**
将HEK 293T细胞暴露于一系列DHA剂量下5天，然后进行细胞计数分析，一式三份（见材料和方法）。结果表示为与对照组相比剩余的平均细胞数（对照生长百分比）±平均值标准误差（SEM）。

**图2。DHA暴露诱导G2/M细胞周期停滞。**
**答：。**使用PI测定用5 mM DHA处理24、48和72小时的HEK 293T细胞的细胞周期。B。暴露24小时后，仅观察到细胞周期的微小变化。到48小时，G2/M细胞数量增加了一倍，而S期细胞数量持续增加，直到72小时，G1细胞数量很少。显示了三个独立实验的每个细胞周期中的平均细胞百分比。**C、。**细胞周期阻滞通过细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白A2从48小时到72小时的逐渐增加得到证实。

**图3。暴露48小时后，DHA诱导的自噬标记物。**
用5 mM DHA处理HEK 293T细胞48、72和96小时。**答：。**DHA暴露后未观察到凋亡标记物PARP-1裂解。然而，观察到自噬标记LC3B II的表达增加。B。此外，还检测了其他自噬标记物，在DHA暴露后仅观察到SIRT1增加。β-actin被用作免疫印迹的负荷控制，并显示了具有代表性的免疫印迹。

**图4。DHA暴露引起的细胞形态变化。**
暴露于5 mM DHA的HEK 293T细胞的差异干涉对比（DIC）图像。作为DHA暴露时间的函数，细胞中的液泡数量增加，在暴露48小时后最明显。到72小时，细胞显示出受损的质膜和核膜完整性。代表性图像以50µm的比例尺显示。

**图5。DHA暴露改变线粒体膜电位和形态。**
**答：。**通过测量未处理细胞和5 mM DHA处理细胞中TMRE的平均荧光强度来评估线粒体膜电位。FCCP解偶联膜电位，导致荧光信号丢失，并作为阳性对照。该图显示了针对细胞数量变化（参见材料和方法）±SEM标准化的三个独立实验的平均荧光强度。B。用超分辨显微镜检查线粒体形态。固定前用MitoTracker CMXRos染色线粒体。显示了具有代表性的单元格。

**图6。DHA在暴露后2小时内会损害线粒体功能。**
**答：。**使用Seahorse Biosciences XF24细胞外通量分析仪测量OCR（顶部）和ECAR（底部）。顶部是2小时后未处理（蓝色）和5 mM DHA处理（红色）的HEK 293T细胞的代表性OCR痕迹。底部是24小时（红色）和48小时（绿色）时未处理（蓝色）和5 mM DHA处理的HEK 293T细胞的代表性ECAR痕迹。B类.OCR显示暴露于5 mM DHA 2 h后耗氧量显著降低。尽管ECAR没有变化。C类.OCR在5 mM DHA暴露24和48小时后变化很大。而ECAR在暴露于5mM DHA后的24小时和48小时都显示出显著的减少。显示了三个独立实验±SEM的平均值**p<0.01和***p<0.001

**图7。摄入DHA后，ATP水平下降。**
用5 mM DHA处理24和48小时后，用CellTiter Glo测定HEK 293T细胞内的总ATP。ATP水平在24小时降至81.8±5.5%，在48小时进一步降至71.5±7.6%。该图显示了三个独立实验的平均发光强度，这些实验根据细胞数量变化进行了标准化，并相对于对照±SEM进行了表达。*p<0.05

**图8。暴露于DHA后，细胞外和细胞内乳酸降低。**
**答：。**在24和48小时将HEK 293T细胞暴露于5 mM DHA后，利用核磁共振检测细胞培养上清液中的乳酸水平。B。在与NMR样品相同的时间点，使用乳酸Glo评估细胞内乳酸水平。显示了三个独立实验±SEM的平均值。

**图9。DHA代谢中NAD（P）H的利用。**
**答：。**显示DHA进入3-碳代谢途径的糖酵解（Embden-Meyerhof）途径。NAD（P）H和ATP的利用以红色突出显示。B。未经处理和5 mM DHA处理的细胞中内源性NADH和NADPH的自荧光图像。**C、。**未经处理和5 mM DHA处理细胞的荧光信号定量。每个时间点都有自己的未经处理的对照物，用于解释在DHA暴露时间内由于中等摄入量引起的NAD（P）H的变化。代表性图像显示在B中，比例尺为50µm。

**图10。纳德⁺含有cpVenus NAD的DHA处理的HEK 293T细胞的细胞质、线粒体和细胞核中的水平⁺绑定传感器。**
来自细胞器传感器（F）和细胞器控制（F）的标准化荧光信号比率的量化₀)显示为细胞质(A类)，线粒体(B类)和原子核(C类)表达细胞器特异性传感器和对照的稳定HEK 293T细胞系。该比率的降低表明游离NAD的增加⁺细胞器内的水平。100µM NRH用作对照，以增加NAD⁺水平**p<0.01

**图11。在DHA暴露期间，谷胱甘肽水平的降低和氧化会发生变化。**
**答：。**在24和48小时，5 mM DHA处理的HEK 293T细胞中的还原型谷胱甘肽（GSH）水平。B。5 mM DHA处理的HEK 293T细胞在24和48小时内的氧化谷胱甘肽（GSSH）。显示了三个独立实验的平均值±SEM*所示对照组之间p<0.05。

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