The DNA Repair Nuclease MRE11A Functions as a Mitochondrial Protector and Prevents T Cell Pyroptosis and Tissue Inflammation

doi:10.1016/j.cmet.2019.06.016

.2019年9月3日；30（3）：477-492.e6。

doi:10.1016/j.cmet.2019.06.016。 Epub 2019年7月18日。

DNA修复核糖核酸酶MRE11A作为线粒体保护剂预防T细胞下垂和组织炎症

附属机构

¹斯坦福大学医学院医学系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
²斯坦福大学医学院生物医学数据科学系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
^三斯坦福大学医学院病理学系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
⁴斯坦福大学医学院医学系，斯坦福，CA 94305，美国。电子地址：cweyand@stanford.edu。

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DNA修复核糖核酸酶MRE11A作为线粒体保护剂预防T细胞下垂和组织炎症

李银音等。单元格元. 2019.

.2019年9月3日；30（3）：477-492.e6。

doi:10.1016/j.cmet.2019.06.016。 Epub 2019年7月18日。

作者

附属机构

¹斯坦福大学医学院医学系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
²美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学医学院生物医学数据科学系，邮编94305。
^三斯坦福大学医学院病理学系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
⁴斯坦福大学医学院医学系，斯坦福，CA 94305，美国。电子地址：cweyand@stanford.edu。

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摘要

在自身免疫性疾病类风湿关节炎（RA）中，CD4⁺T细胞通过分流糖酵解和ATP生成中的葡萄糖来促进促炎效应器功能。潜在机制尚不清楚，这里我们暗示DNA修复核酸酶MRE11A与细胞的生物能量衰竭有关。RA T细胞中MRE11A缺乏扰乱线粒体耗氧量并抑制ATP生成。此外，MRE11A功能丧失导致线粒体DNA（mtDNA）泄漏到胞浆中，触发炎症小体组装、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1激活和热解细胞死亡。RA患者淋巴结驻留T细胞中Caspase-1激活频繁。在体内，MRE11A的药理和遗传抑制导致mtDNA的组织沉积、caspase-1蛋白水解和侵袭性组织炎症。相反，MRE11A的过度表达恢复了线粒体的适应性并保护组织免受炎症攻击。因此，核酸酶MRE11A调节线粒体保护程序，MRE11A缺乏会导致DNA修复缺陷、能量生成、组织内稳态的失败和丧失。

关键词：ATP；DNA损伤修复；MRE11A；T细胞老化；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1；炎症小体；线粒体DNA；热解；类风湿关节炎；组织炎症。

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作者声明没有相互竞争的利益。

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图1： — **图1:。MRE11A调节线粒体功能**
CD4细胞⁺来自5名健康对照的T细胞被转染*MRE11A型*siRNA加/减*MRE11A型*表达质粒并刺激72h。保留一份未被转染。用Seahorse Bioscience XF96分析仪追踪耗氧率（OCR），通过连续添加1，寡霉素，2，FCCP和3，抗霉素A/鱼藤酮来检测线粒体功能。（A） OCR跟踪摘要。（B-D）基线呼吸、ATP-耦合呼吸和最大呼吸。（E）细胞内ATP浓度。（F）采用Seahorse Bioscience XF96分析仪测量细胞外酸化率（ECAR）。（G） RA和对照CD4⁺刺激T细胞（每组6个）72小时。Seahorse分析仪采集OCR跟踪曲线。（H-J）线粒体功能（H）、ECARs（I）和细胞内ATP（J）参数如上所示。细胞溶质、线粒体和核组分中的（K-L）MRE11A。CD4中的（M，N）胞质和线粒体MRE11A⁺RA患者和对照组的T细胞。代表5名对照组和5名患者的免疫印迹。（M） MRE11A双色免疫染色（绿色）和丝裂原追踪（红色）。细胞核标有DAPI（蓝色）。比例尺；5微米。（N）对照组和RA CD4中线粒体质量和线粒体MRE11A的定量⁺T细胞。来自5名对照组和5名患者的小提琴图。显示了荧光强度中值和四分位范围。转染后细胞溶质和线粒体MRE11A蛋白的（O-P）免疫印迹*MRE11A型*或对照siRNA。代表3个样本的免疫印迹。所有数据均为平均值±SEM。ANOVA，包括事后Tukey（B-F）、Mann-Whitney（H-J，N）或试验（L，P）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***<0.0001。另请参见图Sl

图2： — **图2:。MRE11A保护线粒体DNA免受氧化和泄漏**
（A）从Jurkat T细胞中分离出线粒体。结合MRE11A的mtDNA被免疫沉淀、纯化，并通过RT-PCR定量。来自3个实验的数据。（B）健康CD4⁺T细胞（n=5）转染*MRE11A型*-siRNA或参考siRNA，刺激72h。RT-PCR定量细胞线粒体DNA。（C）健康CD4⁺用MRE11A抑制剂Mirin（50μM）或载体处理T细胞（n=5）。RT-PCR测定细胞线粒体DNA。（D） RA和对照CD4⁺刺激6个T细胞72小时。用RT-PCR测定细胞线粒体DNA。（E）流式细胞术检测健康CD4细胞中的mtROS⁺有或没有米林治疗的T细胞。（F）线粒体DNA中8-OH-dG测定的实验方案。（G）对照CD4中MRE11A的表达⁺T细胞被抑制*MRE11A型*-siRNA转染（n=7）。线粒体8-OH-dG通过RT-PCR定量。（H） CD4细胞⁺用mitoTEMPO（10μM）预处理T细胞2h，然后用Mirin处理（50μM）抑制MRE11A活性（n=5）。线粒体8-OH-dG通过RT-PCR定量。（一） CD4细胞⁺对7名RA患者和7名对照组的T细胞进行72小时的刺激。用RT-PCR定量mtDNA 8-OH-dG。（J）将未氧化和氧化的mtDNA和FLICA频率转染Jurkat T细胞⁺用流式细胞仪检测细胞。所有数据均为平均值±SEM。配对t检验（A-C）、Mann-Whitney（D，I）、Wilcoxon符号秩检验（E，G）、方差分析和使用Tukey方法的配对比较（H，J）*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001。另请参见图S2。

图3。 — **图3.MRE11A控制caspase-1的激活**
健康和RA CD4⁺将T细胞刺激72小时，并按指示进行处理。MRE11A活性被抑制*MRE11A型*siRNA转染或Mirin治疗（50μM）。炎症小体被尼日利亚霉素激活。用FLICA探针流式细胞术测定Caspase-1和Caspase-3活性。（A） FLICA的频率⁺CD4细胞⁺Mirin治疗后的T细胞。代表性散射斑点和6个实验的数据。（B） FLICA/caspase-1的频率⁺CD4细胞⁺MRE11A敲除后的T细胞（n=3）。（C）健康CD4细胞caspase-1裂解的免疫印迹⁺按指示处理T细胞。3个实验中p10蛋白的定量。（D-F）对照和RA CD4中胱天蛋白酶激活的比较分析⁺T细胞。（D） FLICA的典型散射斑点⁺细胞。（E） CD4动力学⁺FLICA/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1⁺刺激后第1-5天的T细胞。8对患者对照。（F） FLICA公司⁺CD4细胞⁺11名RA患者在刺激后第3天测量caspase-1和caspase-3的T细胞。（G）刺激后控制和RA CD4中caspase-1裂解的代表性免疫印迹⁺T细胞。（H） p10蛋白定量（n=5）。（一） 7对RA对照组分泌IL-1β的浓度。（J）术后分泌的IL-1β浓度*MRE11A型*击倒。（K） CD4的频率⁺第3天caspase-1活化的T细胞与临床疾病活动指数（CDAI）评估的临床疾病负担相关。（左）*NLRP3、AIM2*和*ASC公司*之后量化的成绩单*MRE11A型*健康CD4基因敲除⁺T细胞。（百万）*NLRP3、AIM2*和*ASC公司*对照组和RA CD4的转录物比较⁺T细胞。（N） FLICA/caspase-1的频率⁺CD4细胞⁺T细胞跟随*NLRP3型*或*人工智能2*击倒和米林治疗。4个样本的代表性直方图和数据。所有数据均为平均值±SEM。Wilcoxon符号秩检验（A，F，L），配对t检验（B，C），方差分析和使用Tukey方法的配对比较（E，J，N），Mann-Whitney（H，I，M）*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001。另请参见图S3。

图4。 — **图4.MRE11A可防止caspase-1依赖性嗜热性T细胞死亡**
（A，B）CD4⁺用MRE11A抑制剂Mirin刺激和处理T细胞。用7AAD流式细胞术测定细胞存活率⁺/膜联蛋白V⁺细胞。代表性斑点印迹和3个样品的数据。（C） CD4细胞⁺T细胞转染*MRE11A型*-siRNA或ref-siRNA。尼日利亚霉素（10μM）可激活炎症小体。7AAD的频率⁺/附录五⁺CD4细胞⁺流式细胞术检测T细胞。来自3个样本的数据。活化CD4中测定的（D，E）细胞活力和LDH释放⁺用Mirin（50μM）处理的T细胞（n=3）。（F）对照组和RA CD4中的T细胞死亡定量⁺刺激后第3天的T细胞。膜联蛋白V的流式细胞术⁺/公元7年⁺CD4细胞⁺T细胞。5对患者对照的典型散射斑点和数据。（G） 5名RA患者和5名对照组的T细胞死亡通过LDH释放进行量化。（H，I）健康CD4⁺在用Mirin阻断MRE11A活性之前，用胱天蛋白酶抑制剂（50μM；48小时）预处理T细胞⁺细胞（H）和膜联蛋白V⁺/公元7年⁺细胞（I）通过流量测量。（J，K）RA CD4⁺用半胱天冬酶抑制剂（50μM）预处理T细胞。FLICA/caspase-1定量T细胞死亡⁺（J）和膜联蛋白V⁺/公元7年⁺（K）细胞频率。（L，M）siRNA介导的对照组和RA CD4中caspase-1的敲除⁺米林治疗前的T细胞FLICA/caspase-1的频率⁺和Annexin V⁺/公元7年⁺通过流式细胞术测量的细胞（n＝5）。（N） FLICA/caspase-1的频率⁺CD4细胞⁺之后的T细胞*NLRP3型*或*人工智能2*敲除和转染从mirin处理的线粒体（O）中分离的mtDNA。对照CD4⁺用米林处理T细胞或分离的线粒体。从线粒体中分离出线粒体DNA，从整个细胞中分离出mtDNA和胞浆DNA，并转染到CD4中⁺T细胞。控制来自未经处理的全细胞的mtDNA。FLICA/caspase-1的频率⁺流式细胞术检测细胞数和细胞死亡。所有数据均为平均值±SEM。方差分析和使用Tukey方法的成对比较（B，H-K，N，O），成对t检验（C-E，L，M），t检验（F，G）*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001。另请参见图S4。

图5： — **图5:。组织沉积T细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的激活**
（A，B）从RA或HIV感染患者的诊断活检中收集淋巴结。（A）健康、RA和HIV感染淋巴结（LN）组织切片中裂解caspase-1（棕色）和CD3（红色）的双色免疫组织化学。箭头表示双阳性单元格。各取3个淋巴结样本的代表性图像。比例尺；20微米。（B） CD3的频率⁺在10个随机选择的高能场（HPF）中具有裂解的胱天蛋白酶-1的T细胞。数据为平均值±SEM。方差分析和使用Tukey方法的两两比较。（C）实验方案。用健康对照组或RA患者的PBMC重建植入人滑膜组织的NSG小鼠。移植滑膜移植物进行图像分析。（D）裂解caspase-1（绿色）和CD3（红色）的双色免疫组织化学。比例尺；20微米。（E） CD3的百分比⁺裂解的胱天蛋白酶-1⁺T细胞。通过Wilcoxon检验比较平均值±SEM*第页<0.05, ***第页<0.001。另请参见图S5。

图6： — **图6:。MRE11A调节组织驻留T细胞中胱天蛋白酶-1的激活和线粒体DNA的泄漏**
将植入人滑膜组织的NSG小鼠与健康PBMC重组。在转移或每日注射MRE11A抑制剂米林（或载体）之前，MRE11A在PBMC中沉默。对照组小鼠只有人类滑膜组织。（A）滑膜外植体中裂解caspase-1（绿色）和CD3（红色）的双色免疫组织化学。比例尺；20微米。（B） CD3的频率⁺具有裂解半胱天冬酶-1的T细胞⁺在18个随机HPF中定量。（C）提取组织mtDNA并测定8-OH-dG，如图2F所示。（D，E）通过RT-PCR进行炎症相关基因的组织转录组分析。（F）组织IHC中切割caspase-1（绿色）和CD3（红色）染色的代表性显微照片。比例尺；20微米。（G） CD3的百分比⁺表达裂解caspase-1的T细胞（12个随机HPF）。（H）从滑膜移植物提取的线粒体DNA中测定8-OH-dG。（I，J）通过RT-PCR进行炎症相关基因的组织转录组分析。通过Wilcoxon检验比较平均值±SEM*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001。另请参见图S6。

图7。 — **图7.MRE11A保护滑膜组织免受炎症的影响**
类风湿关节炎CD4⁺T细胞转染*MRE11A型*构造以恢复MRE11A表达。（A-C）用Seahorse Bioscience XF96分析仪追踪耗氧率（OCR），并如图1（A）总结OCR追踪所示探索线粒体功能。（B）基线呼吸、呼吸与ATP生成耦合、最大呼吸和备用呼吸容量。（C）细胞内ATP浓度。（D） MRE11A过度表达对细胞溶质mtDNA泄漏的影响。（E） MRE11A过度表达后RA T细胞中的氧化mtDNA（8-OH-dG）。（F-G）FLICA/caspase-1的代表性直方图⁺CD4细胞⁺MRE11A过度表达后的T细胞。5个实验的结果。（H）膜联蛋白V的典型散射印迹⁺/7年一遇⁺MRE11A过度表达后的T细胞。（I-N）RA PBMC转染*MRE11A型*构建或控制质粒并过继转移到植入人滑膜的NSG小鼠中。或者，用caspase-1抑制剂VX-765处理嵌合体小鼠。数据来自每个治疗臂的7个滑膜移植物。（一）实验方案。（J）从滑膜移植物提取的线粒体DNA中定量氧化8-OH-dG。（K）滑膜组织切片中裂解caspase-1（绿色）和CD3的免疫组织化学染色⁺T细胞（红色）。（五十） CD3的频率⁺具有裂解半胱天冬酶-1的T细胞⁺7例滑膜移植。（M）从MRE11A过表达实验中获得的8个外植体的组织转录组分析（RT-PCR）。（N）载体或caspase-1抑制剂处理小鼠滑膜外植体的组织转录组分析（RT-PCR）。所有数据均为平均值±SEM。配对t检验（B-E，G，H），Wilcoxon检验（J，L，M，N）*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001。另请参见图S7。

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中的注释

线粒体DNA修复缺陷促进RA炎症。
科里森J。科里森J。 Nat Rev风湿病。2019年10月；15(10):576. doi:10.1038/s41584-019-00303-x。 Nat Rev风湿病。2019 采购管理信息：31477875 没有可用的摘要。

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