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.2019年10月：218:119337。
doi:10.1016/j.biomaterials.2019.119337。 Epub 2019年7月9日。

层粘连蛋白-111的微观结构补偿了乳蛋白下游表达中乳腺上皮细胞中聚糖失调的损失

A J肯特 1, N迈耶 1, J L英曼 1, C霍奇曼·门德斯 2, M J Bissell先生 1, C罗伯逊 三
附属公司

层粘连蛋白111的微观结构补偿了乳蛋白下游表达中乳腺上皮细胞中的肌营养不良聚糖损失

A J肯特等。 生物材料. 2019年10月.

摘要

层粘连蛋白-111（Ln-1）是一种细胞外基质（ECM）糖蛋白，发现于乳腺上皮基底膜中，对泌乳至关重要。在乳腺上皮细胞（MEC）中，dystroglycan（Dg）被认为是层粘连蛋白111聚合成网络所必需的。，因此，我们询问正确的聚合是否可以补偿Dg损失。人工聚合的层粘连蛋白111和层粘连糖蛋白混合物Matrigel都形成了分形维数为1.7到1.8的分支、扩散网络，而中性缓冲液中的层粘着蛋白111形成了没有分形特性的小聚集体（分形维数为2）。在Dg敲除细胞中，聚合层粘连蛋白-111或Matrigel很容易附着到细胞表面，而聚合层粘着蛋白-111则没有。相反，聚合和聚集的层粘连蛋白111与Dg敲除蛋白结合类似。聚合的层粘连蛋白-111和Matrigel都促进细胞成圆、聚集、紧密连接的形成和乳蛋白的表达，而聚合的Ln-1没有附着到细胞或促进功能分化。这些发现支持基底膜Ln-1网络的微结构调节乳腺上皮细胞功能。

关键词：dystrogycan；层粘连蛋白；乳腺分化；微观结构。

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利益冲突

作者没有利益冲突需要披露。

数字

图1。
图1。
分形层粘连蛋白聚合在DgKI细胞上自然发生，在酸性条件下人工发生。A.纯化Ln-1在pH7时在DgKI细胞上的免疫荧光显示，层粘连蛋白粘附并形成花边网络。插图：细胞表面的层粘连蛋白质网络与玻璃表面的层粘蛋白网络显示出不同的形态。B.纯化Ln-1在pH7时对DgKO细胞的免疫荧光表明，层粘着蛋白无法粘附到Dg阴性细胞。插图：细胞表面几乎没有层粘连蛋白，层粘连在无细胞区域的玻璃上形成球状物。C.层粘连蛋白在中性pH7缓冲液中形成小而圆的聚集。D.层粘蛋白-糖蛋白混合物Matrigel™（Mg-Ln）中的层粘蛋白网络形成网状网络。E.层粘连蛋白在酸性pH4缓冲液（polyLM）中形成类似于Mg-Ln的网状网络。F.层粘连蛋白在酸性糖蛋白Nidogen（Nd1-Ln）存在下形成与Mg-Ln类似的聚合层粘连蛋白质网络。G.通过四种测试条件下的计盒维数计算的分形维数。Mg-Ln、polyLM和Nd1-Ln的分形维数均在1.7左右，这是扩散受限聚集体的典型特征，而pH7-Ln的非分形维数为2。H.测试的所有四种脱细胞层粘连蛋白条件的图像功率谱。注意Mg-Ln、Nd1-Ln和polyLM的相似性，尽管合成方法不同。
图2。
图2。
层粘连蛋白网络的电子显微镜表征表明，Mg-LN和polyLM在精细尺度上具有相似性。A-F.pH7-Ln、Mg-Ln和polyLM的扫描电子显微镜，2种分辨率。注意，在高分辨率下，Mg-Ln和polyLM都具有花边网络结构，而pH7-Ln即使在高分辨率时也会形成球状物。理论化网络结构的卡通。在中性pH值下，层粘连蛋白随机组装，形成球状物，而在Dg、低pH值或糖蛋白的存在下，层黏连蛋白组装成原子级六边形晶格网络和超微结构级分形网络。
图3。
图3。
层粘连蛋白聚合影响其对DgKO细胞的粘附。A.用pH7-Ln（i）和polyLM（ii）处理的DgKI细胞中层粘连蛋白的免疫荧光染色显示层粘连素与细胞的粘附相似。B.用pH7-Ln（i）和polyLM（ii）处理的DgKO细胞层粘连蛋白的免疫荧光染色显示细胞表面的pH7-L最小。C-D.Western blots证实了层粘连蛋白与DgKO处理细胞的粘附性不同，而与DgKI处理细胞之间的粘附性没有差异，使用微管蛋白作为负荷控制。E-F.western blots定量（i）和免疫荧光定量（ii）证实polyLM和pH7-Ln与DgKI结合无统计学差异，但DgKO细胞中的pH7-Ln显著减少。（n=3个实验）。
图4。
图4。
层粘连蛋白聚合诱导内源性层粘连素的产生。用荧光标记的层粘连蛋白（A:荧光pH7-Ln，B:荧光聚LM-绿色）处理A-B.DgKO细胞，然后用抗层粘连抗体（红色）固定并复染。这些图像的荧光标记和抗体染色强度的二维直方图。在pH7-Ln条件下，抗体染色显示内源性生成的层粘连蛋白水平较低，但基本上没有标记的外源性Ln-1（灰色箭头）。在polyLM条件下，我们观察到外源性Ln-1（白箭头高抗体染色，高荧光标记）和内源性层粘连蛋白的形成（灰箭头高抗体着色，无荧光标记）。E.pH7-Ln和polyLM条件下内源性和刺激性层粘连蛋白的定量。。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的Web版本。）
图5。
图5。
层粘连蛋白聚合影响DgKO细胞中乳蛋白的表达和菌落形态。polyLM中A.β酪蛋白的表达高于pH7-Ln刺激的DgKO细胞。B.western blots定量显示，在polyLM条件下，β-酪蛋白表达显著升高（n=3个实验）。C–H。低浓度（C）下Mg-Ln、低浓度（D）下polyLM和pH7-Ln（E）下的细胞集落形态均为扁平集落，而高剂量下Mg-Ln-（E）和polyLM-（G）均形成网状网络，层粘连蛋白和β-酪蛋白染色丰富。pH7-Ln在低剂量和高剂量（H–I）下均显示出平展的菌落，没有层粘连蛋白结合。通过免疫荧光染色和定量图像处理观察到，随着polyLM或Mg-Ln剂量的增加，β-酪蛋白的表达增加。β-酪蛋白在50μg/ml Mg-Ln和800μg/ml polyLM中的表达无统计学差异。对于pH7-Ln，未观察到剂量反应行为；800μg/ml时的pH7-Ln与12.5μg/ml下的pH7-2Ln没有差异。（n=3个实验）。J Ln-1染色强度随着Mg-Ln或polyLM刺激的增加而增加，而pH7 Ln没有观察到变化（n=3个实验）。K.自相关分析表明，随着Mg-Ln或polyLM剂量的增加，细胞核的聚集性增加。50或100μg/ml的Mg-Ln和800μg/ml的polyLM与800μg/ml的pH7 Ln在统计学上不同（n=3个实验）。
图6。
图6。
层粘连蛋白聚合影响DgKO细胞的形态。A-D细胞-细胞连接随着层粘连蛋白的治疗而变化。在Mg-Ln条件下（A），心尖紧密连接形成良好，偶尔观察到管腔。在polyLM（B）中，菌落往往组织不太好，但细胞之间的紧密连接组织良好。相反，在pH7-Ln（C）和no-Ln-1对照条件（D）下，观察到细胞之间的间隙（白色箭头）和丰富的肌动蛋白应力纤维（灰色箭头）。E.在Mg-Ln和polyLM条件下，与在pH7-Ln或对照条件下相比，肌动蛋白和ZO-1更有可能通过互相关分析进行共定位。F.pH7-Ln和对照条件下的肌动蛋白染色比Mg-Ln或polyLM条件下的更大，这是通过肌动蛋白强度总和与DAPI染色强度总和的比率来测量的。
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