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.2019年7月19日；10(1):3252.
doi:10.1038/s41467-019-11202-z。

基于TurboID的邻近标记揭示UBR7是N NLR免疫受体介导的免疫的调节因子

张永良 1 2, 高元松 三, Neeraj K拉尔 4, 乌格拉帕·纳加拉克什米 4, 李媛媛 4, 郑文杰 4, 黄炳瑞 4, 苔丝·C·布兰农 5 6 7 8, 爱丽丝·Y·汀 5 6 7 9, 贾斯汀·沃利 10, 萨维瑟拉玛·P·迪内什-库马尔 11
附属公司

基于TurboID的邻近标记揭示UBR7是N NLR免疫受体介导免疫的调节器

张永良等。 国家公社. .

勘误表in

摘要

核苷酸结合富含亮氨酸重复序列（NLR）免疫受体在植物和动物防御病原体方面发挥着关键作用。然而，我们对NLR相互作用蛋白以及调节NLR水平的机制知之甚少。在这里，我们使用邻近标记（PL）来鉴定N近端的蛋白质组，这是一种赋予烟草花叶病毒（TMV）抗性的NLR。对不同PL方法的评估表明，与BioID和BioID2相比，基于TurboID的PL在植物中提供了更有效的生物素化水平。基于TurboID的N的PL，随后进行定量蛋白质组分析和基因筛选，揭示了N介导免疫的多种调节因子。有趣的是，一种推测的E3泛素连接酶UBR7直接与N.UBR7的TIR结构域相互作用，UBR7下调导致N蛋白数量增加，TMV耐药性增强。TMV-p50效应器干扰N-UBR7相互作用并缓解N的负调控。这些发现证明了TurboID-based PL在植物中的效用，以及我们发现的N相互作用蛋白增强了我们对NLR调控机制的理解。

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数字

图1
图1
植物中不同生物素连接酶对杂乱蛋白质生物素化作用的比较与表征。一用于表达三种生物素连接酶的表达盒示意图。在BioID、BioID2和TurboID的C末端添加MYC标记的同时，将柠檬酸融合到N末端。表达受拟南芥泛素-10启动子（pUBQ）和诺巴林合酶终止子（NOSt）。b条生物素连接酶以不同的效率混杂地将植物细胞中的内源性蛋白质生物素化。N.本哈米亚纳分别用含有柠檬烯-BioID-3xMYC（BioID）、柠檬烯-Bio ID2-3xMYC（BioID2）和柠檬烯-TurboID-3xPYC（TurboID）的农杆菌或空载体对照（载体）对叶片进行农业渗透。36 h农业渗透后（hpi），含有缓冲液（−）或200的培养基 µM生物素（+）渗入先前的农业渗透叶片。已渗透N.本哈米亚纳将植物直接在室温（RT）或37 °C室。对收集的组织进行Western blot分析12 生物素渗入后h。链亲和素-HRP和抗MYC抗体分别用于检测生物素化蛋白（顶面板）和不同生物素连接酶（中面板）。PEPC用作等蛋白负荷的负荷控制（底部面板）。每个面板的左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。补充图1b显示了该实验的另一个重复。c（c）基于TurboID的邻近标记所需的最佳生物素浓度的测定在原地如面板上所示，不同浓度的生物素渗入N.本哈米亚纳表达柠檬酸TurboID的叶子。这些植物随后在37 °C室或室温（RT）下8 h后进行western blot分析，如(b条). PEPC用作等蛋白负荷的负荷控制（底部面板）。每个面板的左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。补充图1c显示了该实验的额外重复。d日培养时间对植物中基于TurboID的邻近标记的影响。N.本哈米亚纳表达柠檬酸TurboID的叶片渗透200 μM生物素，然后在37 °C或RT，然后在面板上方所示的不同时间点收集树叶。然后进行蛋白质印迹分析，如图1b所示。由于生物素处理后不同时间点的rbcL蛋白水平不稳定（补充图2），考马斯亮蓝（CBB）染色凝胶中低于rbcL的蛋白带显示为负载控制（底部面板）。每个面板的左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。源数据作为源数据文件提供
图2
图2
N NLR免疫受体近端和相互作用蛋白的鉴定。一用于鉴定N。b条实验设计和标记条件示意图。无p50（I组）或受β-雌二醇诱导启动子控制的p50（II组）的TurboID融合被共同渗透到N.本哈米亚纳叶子。36马力，200 µM生物素和30 µM 17-β-雌二醇渗入两组预先渗入的叶片中。12 h后，裂解叶细胞，用链霉亲和素珠富集生物素化蛋白，用胰蛋白酶消化，并用串联质谱标记（TMT）。每个处理由三个独立的生物重复组成。然后分别将组I或组II中的所有9个样品在组内独立组合，并通过LC-MS/MS进行分析。c（c）第一组和第二组的层次聚类显著丰富了相互作用蛋白。富集的相互作用物表现出比Citrine对照组>1.5倍的富集问-值小于0.05。d日描述在p50缺失或存在时与gN（左）或N-TIR（右）相互作用的蛋白质的维恩图。e（电子）p50缺失（左）或存在（右）时与gN和/或N-TIR相互作用的蛋白质中的重叠
图3
图3
候选N NLR免疫受体相互作用蛋白功能的基因筛选N个-介导对TMV的抗性。一TMV-U1感染的表型观察N个-含有转基因N.本哈米亚纳植物在被不同的靶基因沉默之后。将含有不同基因片段的各种重组TRV载体接种到N个-含有转基因N.本哈米亚纳植物。10天后，TMV-U1被摩擦到上部叶片上。在接种TMV后7天拍摄照片，并显示代表性结果。这些沉默实验重复了2-3次。b条通过RT-PCR（TMV-MP，顶面板）分析上部未接种叶片中运动蛋白编码区对应的TMV RNA。eIF4A被用作内部对照，以验证用于RT-PCR的总RNA的等量（底部面板）。c（c）的静音编号UBR7增强N个-介导对TMV的抗性。TMV-U1-GFP摩擦聚焦到病媒控制或编号UBR7静音N个-含有转基因N.本哈米亚纳叶子。接种后5天在紫外光下拍摄照片，显示了代表性结果（上面板）。d日用抗GFP抗体的western blot分析检测接种叶片中GFP的表达水平（顶面板）。PEPC作为相等蛋白质负载的负载控制（下图）。每个面板的左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。源数据作为源数据文件提供
图4
图4
N和之间的相互作用分析编号UBR7体内和体外。一亚细胞定位编号UBR7。编号UBR7与柠檬酸融合(编号UBR7-柠檬酸），然后进行农业渗透。在2 dpi下进行共聚焦分析。NbUBR7存在于细胞质和细胞核中（左图）。图像右上角的矩形区域表示增益值较低的图像，以确认核定位编号UBR7.比例尺代表10 微米。NbUBR7的表达通过使用针对MYC标签的抗体进行的western blot分析得到确认（右面板）。空矢量用作控件。左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。b条BiFC分析编号UBR7和N及其不同域。编号UBR7融合到柠檬酸的C末端(编号瑞士联合银行7YC公司)与天然启动子驱动的全长N（gN）、TIR结构域缺失的N（gN-ΔTIR）或单独的TIR结构区（N-TIR）共表达，融合到黄嘌呤的N末端N.本哈米亚纳叶子。在2 dpi下进行共聚焦分析。gN公司YN公司和p50U1YC公司作为阳性对照。比例尺 = 10 微米。c（c）体外GST-下拉试验检测编号UBR7和N的TIR结构域。纯化的GFP标记的呼吸爆发氧化酶同系物D（RBOHD）N或C末端区域的TIR域与GST标记的编号UBR7.用谷胱甘肽-谷胱甘苷微球将其拉下后，用抗GFP或抗GST抗体通过Western blot（WB）检测蛋白质。源数据作为源数据文件提供
图5
图5
NbUBR7调节N蛋白水平并作为N个-调解辩护。一 编号UBR7过度表达以蛋白酶体依赖的方式降低了N的稳定性。包含由空载体控制（载体）或包含表达盒的农杆菌组成的表达集编号UBR7-HA或编号UBR7-MYC渗入N.本哈米亚纳叶片随后渗透MYC-标记的gN 24。36 gN渗透后h，50 µM蛋白酶体抑制剂MG132（+MG132）或同等浓度的DMSO（−MG132。收集渗入的叶片组织12 在DMSO或MG132处理后h，并通过蛋白质印迹分析进行分析。用于western blot分析的抗体显示在每个面板的右侧。通过PEPC蛋白质的相似量来评估相同的蛋白质负荷。左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。两个独立样本(n个 = 2） 对每种治疗方法进行平行分析。用Image J软件测量带强度，并将其归一化为PEPC蛋白对照。顶部面板下方的数字表示相应波段强度的相对量化，其中空载体对照组被设置为100%[“±”表示平均值的标准偏差（SD）]。b条双绞线发夹介导的沉默编号瑞士联合银行7(编号UBR7-RNAi）增强了N.空载体控制（载体）或含有发夹的农杆菌的稳定性编号UBR7渗入N.本哈米亚纳叶片随后在24 hpi下渗透MYC-标记的N。36 h后，如上文所述，DMSO（-MG132）或MG132（MG132）渗入预渗透叶片。收集渗入的叶片组织12 DMSO或MG132处理后h，用western blot分析。三个独立的复制品(n个 = 3） 每种治疗都进行一次。顶部面板下方的数字表示相应频带强度的相对量化，其中MG132处理的空矢量控制设置为100%（“±”表示SD）。通过PEPC蛋白质的相似量评估相同的蛋白质负荷（中间面板）。左侧显示了以kDa为单位的分子量大小标记。下调编号渗透叶片中的UBR7也通过RT-qPCR（底部面板）得到确认。将三个生物重复的数据合并，数值显示为平均值 ± 标准偏差。c（c）的RNAi编号UBR7增强了N个-介导对TMV的抗性。叶片的不同区域N个-含有转基因N.本哈米亚纳第一次用发夹渗入土壤编号UBR7（1）和控制空向量（2）。24 h后，TMV-U1-GFP被农业渗透到先前渗透的区域中。在5 dpi的紫外光下拍摄照片，显示了代表性结果（左面板）。然后采集来自区域1和区域2的叶片样本，并使用抗GFP或PEPC抗体进行western blot分析（右上图）。进行RT-qPCR以确认编号UBR7位于叶片浸润区（右下面板）。将三个生物重复的数据合并，数值显示为平均值 ± 标准偏差。d日的过度表达编号UBR7抑制p50效应物诱导的HR-PCD。用MYC标记的N（gN-6xMYC）、TagCFP标记的p50（tCFP-p50）和HA标记的渗透不同的叶区编号瑞士联合银行7(编号UBR7-HA）或柠檬酸（柠檬酸-HA）对照。在6 dpi下拍摄照片，并显示代表性结果（左侧面板）。柠檬烯-HA或编号UBR7-HA通过使用抗HA抗体的Western blot分析得到确认（右面板）。箭头表示不同HA融合的特定波段。源数据作为源数据文件提供
图6
图6
TMV p50效应器干扰编号UBR7和N的TIR域。一p50U1和编号UBR7.用于共渗的结构显示在每个面板的左上角。GUS公司YC公司作为涉及p50U1的关联特异性的对照YN公司.比例尺 = 10 微米。p50U1的表达YN公司和NbUBR7YC公司经western blot分析证实（补充图13b）。b条p50U1和编号UBR7。HA标记的UBR7或柠檬酸与TAP标记的p50在N.本哈米亚纳叶子。从渗透的叶片组织中提取的蛋白质与抗HA抗体结合的琼脂糖珠孵育。蛋白质提取物（输入）或免疫沉淀（IP）复合物通过SDS-PAGE分离，并用抗MYC或抗HA抗体进行探测。p50-TAP与编号UBR7-HA，但不含Citrine-HA。左侧显示了以kDa为单位的分子量标记。c（c）BiFC竞争分析显示p50对编号UBR7和N或编号UBR7和TIR域。BiFC构造与空矢量控制或p50-TAP一起被合并到本氏猪笼草叶子。在2 dpi下进行共聚焦分析。比例尺 = 10 微米。使用Image J软件对重构的柠檬酸荧光强度进行量化，并将p50-TAP增强组作为标准化组（=1）。误差线表示平均值的标准偏差(n个 = 3). 星号表示矢量组和p50-TAP组之间的统计显著性差异（Student’st吨-测试**P（P） = 0.004用于右上面板和**P（P） = 右下面板为0.007）。的表达式编号瑞士联合银行7YC公司通过western blot分析确认p50-TAP（补充图13c）。d日体外竞争性GST下拉试验显示编号随着p50含量的增加，UBR7至TIR结构域被抑制。GST标记编号UBR7或GFP标记的TIR结构域表达并纯化自大肠杆菌在p50（0.1、1、2、4、8）浓度增加的情况下，用谷胱甘肽-甘露糖将这两种蛋白质拉下 微克）。用抗GST或抗GFP抗体对下拉样品进行western blot（WB）分析。底部面板显示了不断增加的p50蛋白的CBB染色。源数据作为源数据文件提供
图7
图7
UBR7在中的功能作用模型N个-介导对TMV的抗性。一在未感染的初始条件下，UBR7与N的TIR域相互作用，导致N的表达相对较低。b条在TMV感染期间，p50效应器通过与UBR7相互作用中断UBR7和N之间的相互作用，从而从N-UBR7复合体中释放N，导致N的稳定性增加和防御激活
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