Igf1R/InsR function is required for axon extension and corpus callosum formation

doi:10.1371/journal.pone.0219362

.2019年7月18日；14（7）：e0219362。

doi:10.1371/journal.pone.0219362。 2019年eCollection。

Igf1R/InsR功能是轴突延伸和胼胝体形成所必需的

京津^1 2, Priyadarshini Ravindran公司¹, 达尼拉·迪梅奥^1 2, 安德烈亚斯·普谢尔^1 2

附属公司

PMID： 31318893
预防性维修识别码： PMC6638864型
内政部： 10.1371/日志.文件0219362

Igf1R/InsR功能是轴突延伸和胼胝体形成所必需的

京津等。公共科学图书馆一号. 2019.

.2019年7月18日；14（7）：e0219362。

doi:10.1371/journal.pone.0219362。 2019年eCollection。

作者

京津^1 2, Priyadarshini Ravindran公司¹, 达尼拉·迪梅奥^1 2, 安德烈亚斯·普谢尔^1 2

附属公司

¹德国慕尼黑慕尼黑大学摩尔库拉雷生物研究所。
²德国明斯特大学运动细胞卓越集群。

PMID： 31318893
预防性维修识别码： PMC6638864型
内政部： 10.1371/日志.文件0219362

摘要

神经系统发育的最早步骤之一是建立神经元极性和形成轴突。促进轴突形成的内在机制已被广泛分析。然而，对启动轴突形成的外源信号知之甚少。这些信号的候选者之一是胰岛素样生长因子1（Igf1），它通过Igf1（Igf1R）和胰岛素受体（InsR）发挥作用。由于Igf1R和InsR可能具有冗余作用，我们分析了Igf1R和InsR均缺乏的条件皮质特异性敲除小鼠，以确定它们是否在体内调节皮质的发育和轴突的形成。我们的结果表明，胚胎海马和扣带回皮质的正常发育需要Igf1R/InsR功能，而外侧皮质的Igf1R没有明显缺陷；Insr淘汰赛。在扣带回皮层，中间祖细胞和深层神经元的数量减少，并且在E17处没有胼胝体。然而，敲除胚胎的皮层组织和轴突形成并没有受损。在培养中，来自Igf1r的皮层和海马神经元；Insr基因敲除胚胎延伸轴突，但轴突的长度严重缩短。我们的结果表明，Igf1R/InsR功能是脑发育所必需的，具有区域特异性，可以促进轴突生长，但对发育中的脑神经元极化和迁移并不重要。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。Igf1r/Insr-Emx1 KO小鼠胼胝体和海马出现缺陷。**
（A） InsR和Igf1R在杂合子（+/-，*免疫球蛋白1r*/督察^+/-以下为：*Insr公司*^{弗洛克斯/+};*免疫球蛋白1r*^{弗洛克斯/+};*Emx1-核心*^C类/+)和纯合子（-/-，*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-以下为：*Insr公司*^{flox/flox公司};*Igf1r抗体*^{flox/flox公司};*Emx1-核心*^C类/+)用Western blot分析E17基因敲除胚胎。残余信号由非神经细胞产生，这些细胞不受由*Emx1-核心*使用抗GAPDH抗体验证了可比较数量的蛋白质的装载。分子量以kDa表示。（B）杂合人脑冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)或纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17 Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎用苏木精和伊红染色。右侧面板中显示了用白色边框标记的区域的放大倍率。箭头标记Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎中缺失的海马区域。刻度条分别为100μm（左面板）和20μm（右面板）。（C）在杂合或纯合Igf1r/Insr-Emx1 KO小鼠的切片中，从垂直于软脑膜表面的心室表面中点开始，在胼胝体水平测定外侧大脑皮层的厚度（n=3个大脑；平均值±s.e.m.；ns，不显著（p>0.05）；Mann-Whitney U试验）。杂合子海马的（D，E）切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用Hoechst 33342（蓝色）、抗Tbr1（D，绿色）和抗NFM（E，绿色）抗体染色。（D，E）中的下面板显示了由白框标记的区域的更高放大率。比例尺分别为100μm（上面板）和20μm（下面板）。CA：角氨；Ctx：皮层；CC：胼胝体；Hp：海马；NE：神经上皮；DG：齿状回；Fb：伞。

**图2。Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎胼胝体发育不全。**
（A-D）杂合子皮层的冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用Hoechst 33342（蓝色）和抗NFM（绿色）、Tuj1（红色）、抗Tbr1（绿色）或抗Ctip2（红色）抗体染色，如图所示。比例尺为100μm。箭头标记胼胝体（杂合对照）。（B）在杂合或纯合Igf1r/Insr-Emx1 KO小鼠的切片中测定扣带回皮质的径向直径（A中的箭头；n=3个大脑；平均值±s.e.m.；*，p<0.05；ns，不显著（p>0.05）；与杂合对照组相比；Mann-Whitney U试验）。（C，D）显示了杂合子和纯合子Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎扣带回皮质100μm宽的柱中Tbr1-（C）或-Ctip2-阳性细胞（D）的数量（与杂合子对照组相比，分析的面积标记为a；n=3个大脑；平均值±s.e.m；*，p<0.05；Mann-Whitney U检验）。

**图3。Igf1r/Insr-Emx1 KO扣带回皮质中中间祖细胞数量减少。**
（A）杂合子皮层冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗PH3（红色）和抗Tbr2抗体（绿色）染色。比例尺为100μm。（B-D）在杂合和纯合Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎（n=3个大脑；平均值±s.e.m.；*，与杂合对照组相比p<0.05；Mann-Whitney U检验。CP：皮质板；SVZ：室下区；VZ：心室区。（E）杂合子皮层冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗Pax6抗体染色（绿色）。比例尺为50μm。（F）在100μm宽的色谱柱中，定量了扣带回皮质中Pax6阳性细胞的数量（n=3个大脑；平均值±s.e.m.；ns，p>0.05；Student’s t检验）。

**图4。Igf1r/Insr-Emx1 KO外侧皮质的放射状胶质细胞不受影响。**
（A）杂合子皮层冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗nestin（红色）或抗Pax6抗体（绿色）和Hoechst 33342（蓝色）染色。下面板显示了（A）中标记区域的放大倍数。比例尺分别为100μm（左面板）和50μm（右面板）。（B）在100μm宽的柱状物中，对外侧皮质中Pax6阳性细胞的数量进行量化（n=3个大脑；平均值±s.e.m.；ns，p>0.05；Student’s t检验）。

**图5。Igf1r/Insr-Emx1 KO外侧皮质的祖细胞不受影响。**
（A）杂合子侧皮质的冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗PH3（红色）和抗Tbr2抗体（绿色）染色。比例尺为20μm。（B-D）在Igf1r/Insr-Emx1 KO和杂合胚胎（n=3个大脑；平均值±s.E.m；ns，p>0.05；Student’s t检验）的外侧皮质中，定量100μm宽的柱中Tbr2（C）、PH3（D）或Tbr2和PH3（E）阳性细胞数。SVZ：室下区；VZ：心室区。

**图6。Igf1r/Insr-Emx1 KO皮质中皮质层的发育不受影响。**
（A，C，E）杂合子外侧皮质冠状切片（+/-：*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子（-/-：*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗Satb2（红色）、Ctip2（红）或-Tbr1抗体（绿色）染色。比例尺为50μm。（B，D，F）显示了Igf1r/Insr-Emx1 KO胚胎的杂合子和纯合子皮层100μm宽的一列中Satb2-、Ctip2-或Tbr1阳性细胞的数量（n=3个大脑；平均值±s.e.m；ns，与杂合子对照组相比p>0.05；Student t检验）。

**图7。Igf1R/InsR信号对胚胎皮层的轴突形成不是必需的。**
（A）杂合子皮层冠状切片(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合子(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)E17基因敲除胚胎用抗NFM（绿色轴突）、SIM312（红色轴突），Tuj1抗体（红色神经元）和Hoechst 33342（蓝色）染色。标记区域的放大倍数较高显示在下部面板中。比例尺分别为100μm（上面板）和20μm（下面板）。CP：皮质板；IZ：中间带；VZ/SVZ：心室区/室下区。（B-D）在五个位置确定IZ（白线）和皮质壁（灰线）的相对直径（D（IZ））。为了选择可比较的位置，沿IZ中部从皮质隔（5）到皮质纹状体边界（1）的线被细分为四个等长的部分。在指定位置1–5处测定直径，并计算出IZ的相对直径d（IZ）=（d_伊兹/d日_c（c）)*100. （C，D）冠状切片用抗NFM（C）或SIM312抗体（D）染色，并在所示的五个位置测定IZ的相对直径（n=3个大脑；平均值±s.e.m.；ns，p>0.05；*，与杂合对照组相比p<0.05；Mann-Whitney U检验）。

**图8。Igf1R和InsR的丢失会损害培养的皮层和海马神经元的轴突延伸。**
（A，B）杂合子皮层（A）或海马（B）的神经元(*Ifg1r公司*/*Insr公司*^+/-)和纯合的(*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-)通过用抗Map2（红色）和Tau-1（蓝色）抗体染色，在培养（d.i.v.）的第3天分析E17敲除胚胎。比例尺为20μm。大多数*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-神经元延伸一个轴突（箭头，上部面板），但有些*免疫球蛋白1r*/*Insr公司*^-/-神经元延伸出Map2和Tau-1阳性的轴突（星号，下部面板）。（C，E）显示了来自皮层（C）和海马体（E）的无轴突的非极化神经元（0）、有单个轴突的极化神经元（1）、有多个轴突的神经元（>1）和有多个不确定轴突的Map2和Tau-1（In）均呈阳性的神经元的百分比（%）（3个实验，n>100个神经元，平均值±s.E.m。；*，与杂合小鼠相比p<0.05；双向方差分析）。（D，F）显示了纯合子和杂合子敲除胚胎的皮层（D）和海马轴突（F）的长度（3个实验，n>50个神经元，平均值±s.e.m.；*，与杂合子小鼠相比p<0.05；Student’s t检验）。

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[1] Funahashi Y.、Namba T.、Nakamuta S.、Kaibuchi K.（2014）。体内神经元极化：在复杂环境中生长。《Curr Opin Neurobiol》27、215–223。10.1016/j.conb.2014.04.009-DOI程序-公共医学

[2] Funahashi Y.、Namba T.、Nakamuta S.、Kaibuchi K.（2014）。体内神经元极化：在复杂环境中生长。《Curr Opin Neurobiol》27、215–223。10.1016/j.conb.2014.04.009-DOI程序-公共医学

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