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.2019年9月；23(9):6411-6428.
doi:10.1111/jcmm.14533。 Epub 2019年7月17日。

长非编码RNA H19通过介导CDH1启动子的甲基化依赖性抑制而导致肺腺癌的进展

高李明 1, 徐树峰 2, 岳正 1, 王平（Ping Wang） 三, 张玲 4, 山山石 5, 童武 5, 杨莉 2, 赵静（音译） 2, 齐天 2, 尹晓波 2, 雷政 1
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长非编码RNA H19通过介导CDH1启动子的甲基化依赖性抑制而导致肺腺癌的进展

李明高等。 细胞与分子医学杂志. 2019年9月.

摘要

肺腺癌是一种常见的肺癌组织学类型，在全球范围内死亡率很高。越来越多的证据表明，长非编码RNA H19（lncRNA H19）和CDH1甲基化与多种肿瘤有关。在这里，我们试图研究lncRNA H19或CDH1甲基化是否会影响肺腺癌的发展。首先，收集肺腺癌组织以检测CDH1甲基化。然后，在肺腺癌A549细胞中检测到lncRNA H19的调节机制主要与lncRNA H29的过度表达、针对lncRNA H19的siRNA、CDH1的过度表达和去甲基化剂A-5az的治疗相一致。检测lncRNA H19和上皮-间充质转化（EMT）相关因子的表达以及细胞增殖、成球能力、凋亡、迁移和侵袭。最后，我们在裸鼠体内观察了异种移植瘤，以确定肺腺癌细胞的致瘤性。LncRNA H19和CDH1的甲基化在肺腺癌组织中高度表达。抑制lncRNA H19表达、CDH1过度表达或去甲基化剂5-Az降低CDH1甲基化的A549细胞除了抑制EMT过程外，还抑制了细胞增殖、成球能力、凋亡、迁移和侵袭。沉默lncRNA H19可以降低CDH1的甲基化水平。体内，具有沉默lncRNA H19、CDH1过度表达或CDH1甲基化降低的A549细胞表现出低致瘤性，这反映在肿瘤较小且肿瘤重量较轻。总之，本研究表明，沉默lncRNA H19抑制EMT和增殖，同时通过抑制CDH1启动子甲基化促进肺腺癌细胞凋亡。

关键词：CDH1；细胞凋亡；上皮-间充质转化；长非编码RNA H19；肺腺癌；甲基化；增殖。

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数字

图1
图1
RT-qPCR、免疫组织化学和MSP显示肺腺癌组织中lncRNA H19高表达、CDH1低表达和CDH1高甲基化。A、 RT-qPCR检测肺腺癌组织中lncRNA H19和CDH1的表达；B、 免疫化学法检测CDH1的表达图（200×）；C、 免疫组化检测CDH1表达的统计图；D、 MSP检测到的CDH1甲基化带，M是指CDH1的甲基化扩增片段（97 bp），U是指CDH2的非甲基化扩增片断（115 bp）。RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；MSP，甲基化特异性聚合酶链反应。*，P（P） < .05与。邻近组织；测量数据显示为平均值±标准偏差，由Student’s分析t吨测试。n=60。实验被独立重复三次
图2
图2
RT-qPCR和Western blot分析结果表明，选择lncRNA H19表达最高、CDH1表达第二低的A549细胞系进行细胞转染。A、 RT-qPCR检测lncRNA H19和CDH1的表达；B、 Western blot分析确定CDH1表达的蛋白带和统计图；C、 MSP检测CDH1甲基化。M是指CDH1甲基化扩增片段（97 bp），U是指CDH2非甲基化扩增片断（115 bp）。D、 RT-qPCR检测CDH1的mRNA表达；E、 Western blot分析检测CDH1蛋白表达。RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1、E-钙粘蛋白；GAPDH，甘油醛‐3‐磷酸脱氢酶；MSP，甲基化特异性聚合酶链反应*P（P）与HFL1细胞系相比<0.05；# P（P）与A549细胞系相比<0.05；& P（P）<0.05 vs模拟组。测量数据表示为平均值±标准偏差，通过单向方差分析进行分析。n=3。实验被独立重复三次
图3
图3
成功构建了CDH1的沉默和过表达质粒。A、 在荧光显微镜下用免疫荧光法检测各组细胞的转染效率。B、 各组细胞转染效率统计图，P（P）<0.05 vs模拟组；C、 转染后通过RT-qPCR检测lncRNA H19和CDH1的表达*P（P）<0.05 vs si‐NC组；# P（P）<0.05 vs siRNA-1组和siRNA-2组；& P（P）<0.05 vs oe‐NC组；D类；oe‐CDH1组CDH1的表达，& P（P）与oe‐NC组相比<0.05。RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；GAPDH，甘油醛‐3‐磷酸脱氢酶；NC，阴性对照。测量数据以平均值±标准偏差表示，并通过单向方差分析进行分析。n=3。实验被独立重复三次
图4
图4
成球实验、CCK‐8实验和流式细胞术证明，lncRNA H19沉默、CDH1过度表达或CDH1去甲基化抑制A549细胞的成球能力和侵袭力，并促进细胞凋亡。A和B，转染后各组A549细胞的成球能力通过成球实验检测；C、 CCK-8法检测A549细胞增殖；D、 Western blot分析检测PCNA和Ki‐67的表达；E、 流式细胞术检测细胞凋亡；F、 A549细胞凋亡的统计图，其中左上象限识别坏死细胞（膜联蛋白V−/PI+），右上象限识别晚期凋亡细胞（膜联蛋白V+/PI+），左下象限识别活细胞（膜联蛋白V‐/PI-），右下象限识别早期凋亡细胞（annexin V+/PI‐）；G、 通过Western blot分析测定Bax、Bcl-2和裂解caspase‐3的表达。lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；CCK‐8，细胞计数试剂盒‐8；PI，碘化丙啶；增殖细胞核抗原；Bcl-2，B细胞淋巴瘤/leukmia‐2；Bax、Bcl-2相关X蛋白；NC，阴性对照；二甲基亚砜；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶*P（P）<0.05 vs oe‐NC组；# P（P）<0.05 vs DMSO组；& P（P）<0.05 vs si‐NC组。测量数据表示为平均值±标准偏差，通过单向方差分析进行分析。n=3。实验被独立重复三次
图5
图5
划痕试验、Transwell分析和免疫荧光显示，沉默lncRNA H19、过度表达CDH1或抑制CDH1甲基化可抑制A549细胞的迁移、侵袭和EMT。A、B，划痕试验检测各组A549细胞转染后的迁移能力；转染后各组A549细胞的侵袭能力；E、 Western blot分析确定EMT相关基因的蛋白带和表达统计图；F、 通过免疫荧光分析测定EMT相关基因的表达。lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；NC，阴性对照；二甲基亚砜；EMT，上皮-间充质转化；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶*P（P）<.05与oe-NC组相比；# P（P）<0.05 vs DMSO组；& P（P）<0.05 vs si‐NC组。测量数据以平均值±标准偏差表示，并通过单向方差分析进行分析。n=20。实验被独立重复三次
图6
图6
RNA‐FISH和CHIP表明，lncRNA H19的沉默抑制CDH1的甲基化。A、 从TCGA数据库检索H19在肺腺癌组织和正常组织中的表达；B、 RNA-FISH检测lncRNA H19的亚细胞定位。C、 基于Meth-Primer软件的CDH1启动子区中的CpG岛；D、 生物网站预测lncRNA H19与CDH1启动子的结合位点；E、 荧光素酶报告基因检测CDH1野生型启动子区的荧光素素酶强度；F、 由荧光素酶报告基因确定的M‐CDH1的荧光素素酶强度；G、 CHIP统计图。lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；NC，阴性对照；二甲基亚砜；RNA‐FISH，RNA荧光原位杂交；ChIP，染色质免疫沉淀；M‐CDH1，甲基化CDH1；DNMT1，DNA甲基转移酶1；DNMT3A、DNA甲基转移酶3A；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶*P（P）<0.05 vs NC组；# P（P）<0.05 vs IgG组。测量数据显示为平均值±标准偏差，由学生分析t吨测试。n＝3。实验被独立重复三次
图7
图7
裸鼠异种移植的结果表明，沉默lncRNA H19、过度表达CDH1或抑制CDH1甲基化可抑制裸鼠A549细胞的致瘤性。A、 B和C，肿瘤组织形态学图像和肿瘤体积和重量的统计图；D、 免疫组化法检测LYVE-1的阳性表达率；E、 LVD统计图；F、 通过Western blot分析确定EMT相关基因的蛋白表达。lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；NC，阴性对照；二甲基亚砜；EMT，上皮-间充质转化；淋巴管内皮透明质酸受体1；LVD，淋巴微血管密度*P（P）<0.05 vs oe‐NC组；# P（P）<0.05 vs DMSO组；& P（P）<0.05 vs si‐NC组。测量数据以平均值±标准偏差表示，并通过单向方差分析进行分析。n=6。实验被独立重复三次
图8
图8
lncRNA H19通过促进CDH1启动子甲基化参与肺腺癌的分子机制。LncRNA H19在肺腺癌中高度表达。LncRNA H19向CDH1启动子区域招募甲基转移酶DNMT1和DNMT3A，导致CDH1D表达上调，从而促进增殖和EMT，同时抑制肺腺癌细胞的凋亡。lncRNA H19，长非编码RNA H19；CDH1，E‐钙粘蛋白；DNMT1，DNA甲基转移酶1；DNMT3A、DNA甲基转移酶3A；EMT，上皮-间充质转化
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