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.2019年7月17日;9(1):10343.
doi:10.1038/s41598-019-46459-3。

Gas6是哺乳动物卵母细胞成熟过程中有丝分裂的相互调节器

附属公司

Gas6是哺乳动物卵母细胞成熟过程中有丝分裂的相互调节器

金京华等。 科学代表. .

摘要

此前,我们发现卵母细胞中生长抑制物特异性基因6(Gas6)表达的沉默通过线粒体过度激活和受精后原核形成的同时失败损害细胞质成熟。在这项研究中,我们报道了Gas6通过调节对卵母细胞完全能力至关重要的促分裂相关基因来调节有丝分裂和保护线粒体活性。基于RNA-Seq和RT-PCR分析,在Gas6沉默的MII卵母细胞中,Gas6抑制的MII卵子中有丝分裂相关基因的表达降低,而线粒体蛋白和Gas6下游靶点Ptpn11的表达增加。有趣的是,GAS6缺失诱导了显著的MTOR激活。Gas6耗竭的MII卵母细胞表现出线粒体聚集,这是由有丝分裂抑制引起的。Gas6缺失的MII卵母细胞的mtDNA拷贝数明显较低。雷帕霉素治疗挽救了有丝分裂,阻止了MTOR和磷酸化-MTOR的增加,并增加了Gas6缺失的MII卵母细胞中有丝分裂相关基因的表达。用线粒体分裂/有丝分裂抑制剂Mdivi-1处理后,所有卵母细胞成熟,这些MII卵母细胞表现出线粒体积累,但Gas6表达降低和受精失败,表现出与RNAi直接靶向Gas6非常相似的现象。综上所述,我们得出结论,Gas6信号通过调节卵母细胞线粒体的动力学和活性,在卵母细胞细胞质成熟的控制中起着至关重要的作用。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
通过qPCR验证RNA-Seq和检查线粒体相关基因转录物的丰度。(一个)根据RNA-Seq分析,在差异表达基因的转录物中,有六个基因与线粒体蛋白质有关(例如。,Phyhipl公司汤米7),的下游目标气体6(第11页)和有丝分裂(例如。,附件2b二进制文件3高级服务2)已选定。(B类)中选定基因的表达变化气体6用qPCR检测dsRNA注入的MII卵母细胞。实验在生物三倍的20个卵母细胞池中进行,数据表示为平均值±SEM。表达水平根据C标准化后的值H1英尺控制,GFP公司dsRNA注射MII卵母细胞;气体6RNA干扰,气体6dsRNA注入MII卵母细胞。星号表示统计显著性第页 < 0.05.
图2
图2
耗尽气体6诱导PTPN11和MTOR通路的激活。(一个)的典型表达模式气体6GV和MII卵母细胞中的下游靶基因。对于PCR,使用单个卵母细胞等效mRNA作为每个基因扩增的模板。GV和MII卵母细胞在在体外0和16的区域性小时。从C计算表达水平标准化后的值H1foo公司。星号表示统计显著性第页 < 0.05. (B类)的qPCR分析气体6下游靶基因气体6-沉默MII卵母细胞,包括第11页Bnip3号机组Mtor公司。表达水平根据C计算标准化后的值H1foo公司.控制,GFP公司dsRNA注入MII卵母细胞;气体6RNA干扰,气体6dsRNA注射MII卵母细胞。星号表示统计显著性第页 < 0.05. (C类)p-PTPN11、PTPN11,BNIP3,p-MTOR和MTOR的Western blot分析气体6-耗尽的MII卵母细胞。之后气体6RNAi、p-PTPN11、PTPN11,p-MTOR和MTOR的表达水平增加,而BNIP3的表达降低。将200个MII卵母细胞的蛋白裂解物装入每个通道。α-TUBULIN用作负荷控制。
图3
图3
气体6RNAi通过抑制线粒体吞噬作用导致线粒体聚集。(一个)线粒体分布和积累异常气体6-沉默的MII卵母细胞。之后GFP公司(a和b)和气体6注射(c和d)dsRNA,MII卵母细胞在含有MitoTracker(线粒体,红色)的M16培养基中预培养30分钟,然后用抗α-管蛋白抗体染色(绿色)。卵母细胞的DNA也用DAPI(蓝色)染色,并用LSCM成像。比例尺指示20μm。(B类)用qPCR方法检测MII卵母细胞自噬相关基因的mRNA表达谱。控制,GFP公司dsRNA注入MII卵母细胞;气体6RNA干扰,气体6dsRNA注入MII卵母细胞。星号表示统计显著性第页 < 0.05. (C类)MII卵母细胞培养后LC3转化(LC3-I转化为LC3-II)的蛋白质印迹分析气体6RNAi治疗。之后GAS6蛋白耗尽气体6RNAi导致LC3-II的减少。将来自200个MII卵母细胞的蛋白质裂解物装载到每个泳道中。α-TUBULIN作为负载对照。
图4
图4
气体6RNAi处理导致线粒体DNA丢失和线粒体转录受损。(一个)卵母细胞成熟过程中mtDNA编码基因的典型表达模式。数据表示为平均值±扫描电镜(B–D)的表达式mt-Nd1号(B类),mt-Nd6(C类)、和mt-Atp6型(D类)英寸气体6-沉默的GV和MII卵母细胞。mtDNA编码基因的转录水平在气体6RNAi。控制,GFP公司dsRNA注射MII卵母细胞;气体6RNA干扰,气体6dsRNA注入MII卵母细胞。不同字母(a~c)表示在第页 < 0.05. (E类)小鼠卵母细胞成熟过程中mtDNA拷贝数的测量。MII卵母细胞的mtDNA拷贝数高于GV卵母细胞。星号表示统计显著性第页 < 0.01,由成对的-测试。(F类)气体6根据卵母细胞的发育阶段,断裂对线粒体DNA含量有相反的影响。GV、,气体6注射dsRNA的卵母细胞在IBMX补充剂中培养8小时;信息产业部,气体6注射dsRNA的卵母细胞在IBMX补充剂中培养8小时后接16在普通M16培养基中培养数小时。不同的字母(a和b)表示在第页 < 0.05.
图5
图5
阻断MTOR信号可以缓解由以下因素引起的有丝分裂抑制气体6减少。(一个)雷帕霉素治疗降低了对照组和对照组的MTOR和p-MTOR蛋白水平气体6-沉默的MII卵母细胞。将150枚MII卵母细胞的蛋白裂解物装入每条通道。α-TUBULIN用作加载控制,未处理;+,雷帕霉素治疗。(B类)自噬相关基因的mRNA表达谱在气体6雷帕霉素治疗的RNAi。不同字母(a~c)表示在第页 < 0.05. (C类)雷帕霉素灭活MTOR导致线粒体含量降低,线粒体聚集物消失(红色染色)气体6使卵母细胞沉默。雷帕霉素处理后,MII卵母细胞在含有MitoTracker(线粒体,红色)的M16培养基中预培养30分钟,然后用抗α-管蛋白抗体染色(绿色)。卵母细胞DNA也用DAPI(蓝色)染色,卵母细胞用LSCM成像。比例尺指示20μm。
图6
图6
相互调节气体6卵母细胞的有丝分裂。(一个)Mdivi-1处理增加了卵母细胞的线粒体含量。之后在体外用Mdivi-1成熟卵母细胞,卵母细胞用MitoTracker(线粒体,红色)和抗α-管蛋白抗体(绿色)染色。卵母细胞DNA也用DAPI(蓝色)染色,卵母细胞用LSCM成像。比例尺指示20μm。(B类)计算线粒体跟踪器强度,增加的线粒体含量的图形表示如所示(B类). 数据表示为平均值±SEM。不同的字母(a~b)表示第页 < 0.05. (C类)在卵母细胞成熟过程中,用载体(DMSO)作为对照或用Mdivi-1处理的卵母细胞的显微照片显示,大多数卵母细胞发育为MII。比例尺指示100μm。(D类)在体外Mdivi-1刺激后小鼠卵母细胞的成熟率没有改变。(E类)用Mdivi-1刺激导致抑制气体6mRNA表达与载体组的表达比较(*第页 < 0.01). (F类)Mdivi-1对有丝分裂的抑制导致PN形成受损,这表明在气体6RNAi卵母细胞。GV卵母细胞在无载体或含Mdivi-1的M16培养基中培养,然后在在体外文化。黑点圆圈表示PN的形成。比例尺指示50μm。(G公司)之后形成PN的卵母细胞百分比在体外施肥。n.d.,未检测到。
图7
图7
气体6RNAi治疗通过MTOR依赖的线粒体吞噬抑制导致线粒体功能障碍和积聚。气体6沉默诱导的PTPN11激活和BNIP3抑制导致卵母细胞MTOR活性增加。这些卵母细胞表现出自噬相关基因表达和自噬体形成的减少。此外,气体6-由于有丝分裂受到抑制,耗尽的卵母细胞有异常大量的线粒体。这些线粒体倾向于聚集在细胞质中的纺锤体周围。因此气体6通过MTOR依赖性的有丝分裂抑制导致线粒体质量低和数量改变,导致MII卵母细胞功能不全,尽管成熟后其外观正常,极体形成。蓝色折断箭头表示当前研究中可能的刺激途径,尚待大量实验数据揭示。

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