Inactivating mutations and X-ray crystal structure of the tumor suppressor OPCML reveal cancer-associated functions

doi:10.1038/s41467-019-10966-8

.2019年7月17日；10(1):3134.

doi:10.1038/s41467-019-10966-8。

抑癌基因OPCML的失活突变和X射线晶体结构揭示了肿瘤相关功能

附属公司

¹马萨诸塞大学医学院病理学系，马萨诸塞州伍斯特，01655，美国。
²UCB Pharma，英国SL1 3WE，Slough，Bath Road。
^三卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。
⁴伦敦帝国理工学院化学系，Wood Lane，伦敦，W12 0BZ，英国。
⁵伦敦帝国理工学院医学院外科和癌症系计算与系统医学，SW7 2AZ，英国。
⁶马萨诸塞大学医学院病理学系，马萨诸塞州伍斯特，01655，美国。lawrence.stern@umassmededu。
⁷卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。c.recchi@imperial.ac.uk。
⁸卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。h.gabra@imperial.ac.uk。
⁹英国剑桥SG8 6HB阿斯利康IMED生物技术部早期临床开发临床发现部。h.gabra@imperial.ac.uk。

PMID： 31316070
预防性维修识别码： PMC6637204型
内政部： 10.1038/s41467-019-10966-8

抑癌基因OPCML的失活突变和X射线晶体结构揭示了肿瘤相关功能

詹姆斯·R·伯特利等。国家公社. 2019.

.2019年7月17日；10(1):3134.

doi:10.1038/s41467-019-10966-8。

附属公司

¹马萨诸塞大学医学院病理学系，马萨诸塞州伍斯特，01655，美国。
²UCB Pharma，英国SL1 3WE，Slough，Bath Road。
^三卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。
⁴伦敦帝国理工学院化学系，伦敦伍德巷，W12 0BZ，英国。
⁵计算与系统医学，英国伦敦帝国理工学院医学院外科和癌症系，SW7 2AZ，伦敦。
⁶马萨诸塞大学医学院病理学系，马萨诸塞州伍斯特，01655，美国。lawrence.stern@umassmededu。
⁷卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。c.recchi@imperial.ac.uk。
⁸卵巢癌行动研究中心，外科和癌症系，伦敦帝国理工学院，伦敦杜坎路，W12 0NN，英国。h.gabra@imperial.ac.uk。
⁹英国剑桥SG8 6HB阿斯利康IMED生物技术部早期临床开发临床发现部。h.gabra@imperial.ac.uk。

PMID： 31316070
预防性维修识别码： PMC6637204型
内政部： 10.1038/s41467-019-10966-8

摘要

OPCML是一种肿瘤抑制基因，在卵巢癌和其他癌症中经常被表观遗传学沉默。在这里，我们通过分析肿瘤序列数据库，通过将这种糖蛋白的X射线晶体结构解析到2.65Å的分辨率，观察了不同肿瘤类型的OPCML体细胞错义突变，以及这些突变对OPCML功能的影响。OPCML由三个免疫球蛋白样结构域的延伸排列组成，并通过膜-远侧结构域之间的接触网络进行同源二聚体化。我们报告了一组具有代表性临床突变的OPCML变异体的产生，并在体内外显示出明显的表型效应，包括凤尾鱼非依赖性生长的变化、与激活的同源受体酪氨酸激酶的相互作用、细胞迁移、体外侵袭和体内肿瘤生长。我们的结果表明，OPCML中临床上发生的体细胞错义突变可能导致多种癌症的发生。

PubMed免责声明

利益冲突声明

H.G.是阿斯利康（AstraZeneca）肿瘤临床研究副总裁兼主管（同时担任伦敦帝国理工学院（Imperial College London）肿瘤医学终身教授），拥有开发基于OPCML的治疗药物的专利所有权（包括专利权）。其余作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
OPCML同二聚体的晶体结构。一覆盖在透明表面上的带状表示说明了OPCML的二聚体结构。一个单体是蓝色的，另一个是小麦。N-连接糖基化（天冬酰胺70、293和306上）显示为橙色球体。星号表示P95的位置。显示N和C端子。红色平行线显示OPCML相对于质膜的相对方向（在细胞外侧）。显示比例尺以说明最大尺寸。b条表示与中相同一但从顶部来看。虚线矩形表示二聚化界面上的关键残基，详见**c（c）**.c（c）D1-D1同二聚体界面。一个单体的Arg 65与另一个单体的Asp形成盐桥。Arg 65以下是涉及Trp 82、Ile 74、Leu 69和Thr 114的堆叠相互作用。与中的颜色方案相同一,b条α-碳主链显示为细线。d日小麦中包含P95残基的β-转角的棒状表示。残基92-94和97-99分别构成D和Eβ链的一部分。氢键用虚线表示。**e（电子）**WT OPCML的小角度X射线散射分析。测量了散射曲线，并将其与晶体结构中的二聚体和OPCML单体模型的计算数据进行了比较。二聚体的适合性(χ = 0.50）比单体更匹配(χ = 2.35).（f）WT OPCML的对距离分布函数曲线。曲线截取x个-轴位于对 = 189 ？，表示单个散射粒子中的最大原子距离。这个与模型无关的参数与人工测量的二聚体结构的最大尺寸一致（~180 Å），并且明显大于单体结构的最大尺寸（~124 Å）

图2
OPCML晶体结构同二聚体上最常见突变的映射。OPCML同二聚体以填空表示，其中一个单体为白色，另一个为小麦。强调了与小麦单体相关的突变。结构域1和3中的突变绘制在二聚体的外部，而结构域2相关的突变显示在内部。最常见的突变位点（突变8或9次的位点）以蓝色显示，残基名称以粗体显示。突变4、5或6次的残留物显示在海洋中，突变3次的残渣显示在天蓝色中。为了简单起见，除了K230之外，未突出显示1或2次发现的突变

图3
R65L、N70H和P95R突变体在体外显示其肿瘤抑制功能丧失。用空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变型（R65L、N70H和P95R）OPCML转导SKOV3、PEA1和PEO1卵巢细胞系，并通过western blot分析其蛋白表达(一)共焦显微镜下的蛋白质表达/定位(b条)带有抗OPCML抗体。GAPDH或肌动蛋白被用作a。中右侧面板中的示例一在没有热变性的情况下运行。比例尺 = 20 微米。然后测试细胞迁移(**c（c）**)和入侵(d日)在transwell分析中以及琼脂糖中非锚定生长(**e（电子）**). 所有图表都显示了平均值 ± 三个独立实验的s.d。学生t-test将CTRL和变种与野生型OPCML进行比较：*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001****第页 < 0.0001.（f）将生长为球形的SKOV3细胞进行血清饥饿处理，用指定的重组蛋白（rOPCML、rR65L、rN70H、rP95R）处理，嵌入Matrigel中，然后用血清刺激。3天后对球体的侵入进行量化。比例尺 = 250 微米。图表显示了平均值 ± 三个独立实验的s.e.m。学生t检验将对照组和突变重组蛋白与野生型rOPCML进行比较：**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.克对表达所示野生型和突变OPCML的SKOV3细胞进行裂解，并通过western blot分析EGFR、HER2和AKT的总表达和磷酸化水平。GAPDH被用作加载控制

图4
R65L、N70H和P95R突变体与AXL和FGFR1的相互作用不同。将表达空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变体（R65L、N70H和P95R）的SKOV3 OPCML模拟30 最小值或3 h带GAS6(一)或FGF1(b条)以及OPCML和AXL之间的交互(一)或OPCML和FGFR1(b条)通过邻近连接分析（DuoLink）进行分析和量化。三个独立实验的值，每个实验有五张图像，都显示在一起。条形图表示平均值 ± s.e.m.学生t吨-测试：*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001.c（c）,d日哺乳动物双杂交试验。用指定的单个结构和相对空质粒（未指定）或表达OPCML或P95R加AXL的两种质粒转染细胞(**c（c）**)或加上FGFR1(d日). 条形图表示平均值 ± 根据三个独立实验的所有重复值计算得出的s.e.m。与野生型OPCML和AXL相比的学生t-test(**c（c）**)或OPCML加FGFR1(d日): ***第页 < 0.001****第页 < 0.0001.e（电子）缝隙闭合分析。表达所示野生型和突变型OPCML的SKOV3细胞被血清饥饿，然后在没有刺激（−）的情况下离开，或如所示用GAS6或FGF1刺激。15岁后拍摄迁移图像 h、虚线突出了迁移前沿。比例尺 = 200 微米。**（f）**,克表达所示野生型和突变型OPCML的SKOV3细胞需要血清，然后用GAS6刺激(**（f）**)或FGF1(克)对于30 最小值或3 h.通过western blotting分析细胞裂解产物中总AKT和磷酸化AKT和ERK的表达。Calnexin用作负荷控制。小时,我表达所示野生型和突变型OPCML的SKOV3细胞用AXL抑制剂R428处理2天，以评估IC50(小时)或用于1 测量细胞凋亡的天数(我). 学生t吨-该测试将CTRL和变种与野生型OPCML进行了比较：***第页 < 0.001****第页 < 0.0001. 两个图都显示了平均值 ± 三个独立实验的s.e.m

图5
P95的突变显示出类似的肿瘤抑制功能和AXL相互作用的丧失。用空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变体（P95R、P95L、P95S）OPCML转导SKOV3细胞，并通过共聚焦显微镜分析蛋白质表达/定位(一)和蛋白质的表达(b条)带有抗OPCML抗体。比例尺 = 5 微米。细胞饥饿，然后用GAS6刺激30 最小值，3 h或12 h，以及PLA测量的OPCML和AXL之间的相互作用(**c（c）**)western blotting检测到pAKT信号(d日)，通过间隙闭合分析测试迁移(**e（电子）**)以及通过Matrigel中的3D球体入侵分析研究入侵(**（f）**). GAPDH被用作b条,d日.这些图像是在共聚焦显微镜下拍摄的一或倒置显微镜**e（电子）**和**（f）**.比例尺 = 200 微米(**e（电子）**)和250 微米(**（f）**). 所有图表都显示了平均值 ± 三个独立实验的s.e.m。学生t吨-该测试将CTRL和突变体与野生型OPCML进行了比较，结果为24 侵入时间：*第页 < 0.05, ****第页 < 0.0001

图6
D2和D3的点突变导致功能丧失。用空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变型（R71C、E201Q、S203R、R214Q、K230R、K239N、M278I）OPCML转导SKOV3细胞，并通过western blot分析蛋白表达(一)共焦显微镜下的蛋白质表达/定位(b条)带有抗OPCML抗体。GAPDH被用作一.比例尺 = 5 微米。然后测试细胞迁移(**c（c）**)和入侵(d日)在transwell分析中以及琼脂糖中非锚定生长(**e（电子）**). 比例尺 = 50 微米(**c（c）**,d日)和200 微米(**e（电子）**). 所有图表都显示了平均值 ± 三个独立实验的s.e.m。学生t吨-该测试将CTRL和变种与野生型OPCML进行了比较：**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001****第页 < 0.0001

图7
不同的域介导不同的功能。一分析用空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变型（左面板D1中的R65L、N70H、R71C、P95R、P95L、P95S，中央面板D2中的E201Q、S203R、R214Q，右面板D3中的K230R、K239N、M278I）转导的SKOV3细胞的增殖情况。CTRL细胞用洋红色表示，野生型OPCML用黑色表示，突变体用浅蓝色表示。所有图表都显示了平均值 ± 四个独立实验的s.d。b条——**e（电子）**不同的细胞系被镀在I型胶原上(b条)，IV型胶原蛋白(**c（c）**)，纤维连接蛋白(d日)或层粘连蛋白(**e（电子）**)，并在1 h.数值已标准化为CTRL.比例尺 = 50 微米。所有图表都显示了平均值 ± 域1的三个独立实验和域2和域3的两个独立实验的s.e.m。学生t吨-该测试将CTRL和变种与野生型OPCML进行了比较：*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001****第页 < 0.0001

图8
在体内模型中，点突变损害OPCML肿瘤抑制功能。一将表达空载体（CTRL）、野生型（OPCML）或突变型（R65L、N70H和P95R）OPCML的SKOV3细胞分别腹腔注射给5只雌性运动小鼠。如图所示，收集肿瘤和腹水，并分别以克和毫升为单位进行测量。平均值由点图中的一条线表示。学生t吨-该测试将CTRL和变种与野生型OPCML进行了比较：*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. 比例尺 = 1 厘米。b条表达GFP的SKOV3细胞和所示的构建物生长在鸡胚绒毛膜-尿囊膜顶部的Matrigel中。切除肿瘤，成像并测量GFP阳性面积。比例尺 = 500 微米。图表显示了平均值 ± 三个鸡蛋的扫描电镜。学生t-test将CTRL和变种与野生型OPCML进行比较：***第页 < 0.001****第页 < 0.0001

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1. Sellar GC等。11q25的OPCML表观基因失活，在上皮性卵巢癌中具有抑癌作用。自然遗传学。2003;34:337–343. doi:10.1038/ng1183。-内政部-公共医学
1. Baroy T等。临床前骨肉瘤模型中LSAMP的再表达抑制肿瘤生长。摩尔癌症。2014;13:93. doi:10.1186/1476-4598-13-93。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Ntougkos E等。上皮性卵巢癌中的IgLON家族：表达谱和临床病理相关性。临床。2005年癌症研究；11:5764–5768。doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-2388。-内政部-公共医学
1. McKie AB等。OPCML肿瘤抑制因子在上皮性卵巢癌中起细胞表面抑制因子衔接子的作用，负调控受体酪氨酸激酶。癌症迪斯科。2012;2:156–171. 数字对象标识代码：10.1158/邮编：2159-8290-11-0256.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Sellar GC等。11q25的OPCML表观基因失活，在上皮性卵巢癌中具有抑癌作用。自然遗传学。2003;34:337–343. doi:10.1038/ng1183。-内政部-公共医学

[4] Sellar GC等。11q25的OPCML表观基因失活，在上皮性卵巢癌中具有抑癌作用。自然遗传学。2003;34:337–343. doi:10.1038/ng1183。-内政部-公共医学

[5] Baroy T等。临床前骨肉瘤模型中LSAMP的再表达抑制肿瘤生长。摩尔癌症。2014;13:93. doi:10.1186/1476-4598-13-93。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Baroy T等。临床前骨肉瘤模型中LSAMP的再表达抑制肿瘤生长。摩尔癌症。2014;13:93. doi:10.1186/1476-4598-13-93。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Ntougkos E等。上皮性卵巢癌中的IgLON家族：表达谱和临床病理相关性。临床。2005年癌症研究；11:5764–5768。doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-2388。-内政部-公共医学

[8] Ntougkos E等。上皮性卵巢癌中的IgLON家族：表达谱和临床病理相关性。临床。2005年癌症研究；11:5764–5768。doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-2388。-内政部-公共医学

[9] McKie AB等。OPCML肿瘤抑制因子在上皮性卵巢癌中起细胞表面抑制因子衔接子的作用，负调控受体酪氨酸激酶。癌症迪斯科。2012;2:156–171. 数字对象标识代码：10.1158/邮编：2159-8290-11-0256.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] McKie AB等。OPCML肿瘤抑制因子在上皮性卵巢癌中起细胞表面抑制因子衔接子的作用，负调控受体酪氨酸激酶。癌症迪斯科。2012;2:156–171. 数字对象标识代码：10.1158/邮编：2159-8290-11-0256.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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