Calpain 9 as a therapeutic target in TGFβ-induced mesenchymal transition and fibrosis

doi:10.1126/scitranslmed.aau2814

.2019年7月17日；11（501）：eaau2814。

doi:10.1126/scitranslmed.aau2814。

钙蛋白酶9作为转化生长因子β诱导的间充质转化和纤维化的治疗靶点

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。
²美国马里兰州巴尔的摩医学院细胞和分子医学项目，邮编21205。
^三康奈尔大学梅尼格生物医学工程学院，美国纽约州伊萨卡市，14853。
⁴美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科，邮编21205。
⁵美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院心内科，邮编21205。
⁶约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院环境健康科学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。
⁷日本东京都会医学院生物分子高级科学系，东京156-8506。
⁸美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。hdietz@jhmi.edu。
⁹霍华德·休斯医学院，美国马里兰州雪佛兰大通，邮编：20815。

PMID： 31316008
预防性维修识别码： PMC7351287号
内政部： 10.1126/scitranslmed.aau2814

钙蛋白酶9作为转化生长因子β诱导的间充质转化和纤维化的治疗靶点

大卫·H·金等。科学转化医学. 2019.

.2019年7月17日；11（501）：eaau2814。

doi:10.1126/scitranslmed.aau2814。

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。
²美国马里兰州巴尔的摩医学院细胞和分子医学项目，邮编21205。
^三康奈尔大学梅尼格生物医学工程学院，美国纽约州伊萨卡市，14853。
⁴美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科，邮编21205。
⁵美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院心内科，邮编21205。
⁶约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院环境健康科学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。
⁷日本东京都会医学院生物分子高级科学系，东京156-8506。
⁸美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。hdietz@jhmi.edu。
⁹霍华德·休斯医学院，美国马里兰州雪佛兰大通，邮编：20815。

PMID： 31316008
预防性维修识别码： PMC7351287号
内政部： 10.1126/scitranslmed.aau2814

摘要

纤维化是慢性疾病的常见病理结果，导致正常组织实质被肌成纤维细胞产生的富含胶原蛋白的细胞外基质所替代。虽然通过间充质转化产生肌成纤维细胞的祖细胞类型和细胞程序在组织和疾病之间可能有所不同，但它们对纤维化的发生、维持和进展的作用被认为是普遍的。在这里，我们表明转化生长因子-β（TGFβ）有效诱导培养的上皮细胞、内皮细胞或静止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的能力取决于二聚钙蛋白酶的诱导表达和活性，非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族，通过对不同底物的翻译后修饰来调节各种细胞事件。基于siRNA的基因沉默表明，TGFβ诱导的小鼠乳腺上皮细胞系间充质转化依赖于钙蛋白酶9（CAPN9）表达的诱导，钙蛋白酶9是一种以前被认为局限于胃肠道的亚型。由于双等位基因靶向，小鼠缺乏功能性CAPN9第9章它们能够存活和繁殖，但对博莱霉素诱导的肺纤维化、四氯化碳诱导的肝纤维化以及血管紧张素II诱导的心脏纤维化和功能障碍具有明显的保护作用。预测的CAPN9功能丧失等位基因在东南亚很常见，纯合子频率与Hardy-Weinberg平衡预测相匹配。再加上生理环境下CAPN9表达的高度空间限制模式和小鼠基因敲除的热情，这些数据为针对CAPN9拮抗的纤维化治疗策略的耐受性提供了有力的证据。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：H.C.D.和D.H.K.是题为“靶向Capn9/Capns2活性作为治疗肌成纤维细胞分化和相关病理的治疗策略”的专利申请PCT/US2015/048739的共同发明人。H.C.D.还是Blade Therapeutics Inc.的创始人和科学顾问，并持有该公司的股权。D.H.K.是Blade Therapeutics Inc.的员工并拥有其股份。

数字

图1。 — **图1.广谱钙蛋白酶抑制减弱TGFβ诱导的NMuMG细胞EMT。**
(A类)所示蛋白质、TGFβ刺激后的时间点和MDL-28170浓度的代表性免疫印迹（左侧，括号表示相同的凝胶）和定量（右侧，归一化为GAPDH）(n个=3至4）。(B)用E-钙粘蛋白（绿色）、F-肌动蛋白（红色）和DAPI（蓝色）染色的NMuMG细胞中TGFβ诱导的EMT的代表性免疫荧光图像。比例尺：100µm。(C类)相对基因表达（标准化为*Gapdh公司*)对TGFβ有或无钙蛋白酶抑制（MDL）的反应(n个= 3). (D类)指示蛋白质的代表性免疫印迹（左）和定量（右）、TGFβ刺激后的时间点和钙肽浓度(*n个=*3). (E类)指示蛋白质的代表性免疫印迹（左）和定量（右）、TGFβ刺激后的时间点，以及钙通道阻滞剂2-APB的浓度(n个= 3). 数据表示为平均值±标准误差**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*<0.001，通过Tukey的单向方差分析*事后（post-hoc）*测试。

图2。 — **图2二聚钙蛋白酶亚型CAPN9和CAPNS2介导NMuMG细胞中TGFβ诱导的EMT。**
(A类)在有或无CAST-IRES-GFP过表达的TGFβ刺激后，指示蛋白质和时间点的代表性免疫印迹（左，括号表示相同的凝胶）和定量（右，归一化为GAPDH）(n个= 3). 二聚钙蛋白酶亚单位siRNA敲除的代表性αSMA免疫印迹（左）。(B)CAPN1（机罩1）(n个＝4）(C类)CAPN2号机组(n个= 3), (D类)机长1(n个= 3), (E类)第9章(n个=5），以及(F类)机长2(n个=3)和量化（右，归一化为GAPDH），有或没有TGFβ刺激。数据表示为平均值±标准误差**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*<0.001，通过Tukey的单向方差分析*事后（post-hoc）*测试。

图3。 — **图3.二聚钙蛋白酶抑制抑制原发性PAVECs中TGFβ诱导的间充质转化。**
(A类)TGFβ1刺激PAVECs 48 h后的相对基因表达铸件过度表达标准化为*GAPDH公司*(n个=3). (B)相对基因表达（标准化为*GAPDH公司*)对TGFβ有或无siRNA敲除*机长2*(n个= 3). (C类)用E-cadherin（绿色）、vimentin（红色）和DAPI（蓝色）染色的PAVEC中TGFβ诱导EnMT的代表性免疫荧光图像。比例尺：100µm。所有的定量数据都整合了以生物一式四份进行的每个实验。数据表示为平均值±标准误差**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*Holm-Sidak单因素方差分析结果<0.001事后（post-hoc）测试。

**图4。。*第9章*^−/−小鼠受到博莱霉素诱导的肺纤维化的保护。**
(A类)用生理盐水或博来霉素和*第9章*^−/−博莱霉素治疗小鼠。比例尺：500µm。(B)Masson三色染色小鼠肺纤维化评分(n个=3至8）。(C类)肺胶原蛋白含量*第9章*^−/−或用生理盐水或博莱霉素（Bleo）治疗的野生型对照小鼠(n个=4至6）。(D类)生存曲线*第9章*^−/−用生理盐水或博莱霉素治疗野生型对照小鼠。将三个独立实验的结果合并在一起。(E类)呼吸阻力(n个=3至6）(F类)总肺容量(n个=3至4）和(**G公司**)肺顺应性(n个=3至6）盐水（Sal）和博莱霉素处理野生型和*第9章*^−/−老鼠。(**H（H）**)小鼠肺代表性IF染色为αSMA（红色）或DAPI（蓝色）。比例尺：100µm。(我)钙蛋白酶mRNA标准化为*Gapdh公司*用生理盐水（S）或博来霉素（B）治疗野生型小鼠肺(*C1/2/9/s1/s1*是*上限1/2/9/s1/s2*分别为，n个=3至5），以及(J型)和代表*第9章*（顶部，比例尺：20µm，插图为1.5倍放大倍数）和*学报2*和*第9章*（底部，比例尺：10µm）小鼠肺部的RNA-ISH。通过Holm-Sidak的单向方差分析，将点图数据表示为平均值±标准误差*P<0.05，**P<0.01，†P<0.005，P<0.001事后（post-hoc）测试(B,C类,E类-**G公司**)，对数库测试(D类)和Student的t检验(我).

**图5。。*第9章*^−/−小鼠受到CCl的保护₄-诱导肝纤维化。**
(A类)典型的小鼠肝脏黑色素瘤红色染色载玻片的低倍亮视野图像。比例尺：400µm。(B)偏振光下典型的苦味酸红染色肝脏。比例尺：200µm。(C类)苦味酸红染色小鼠肝脏纤维化评分(n个=4至5）。(D类)肝脏中的胶原蛋白含量*第9章*^−/−或用玉米油或CCl治疗的野生型对照小鼠₄(n个=4至5）。(E类)代表性RNA-ISH第9章用玉米油或CCl处理的小鼠的野生对照小鼠肝脏₄（红色，比例尺：100µm）。(F类)小鼠损伤前后血清肝功能检测(n个=4至5）。数据表示为平均值±标准误差。^纳秒*P（P）*>0.05时**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*Holm-Sidak单因素方差分析结果<0.001事后（post-hoc）测试(C类,D类)和Tukey的双向方差分析*事后（post-hoc）*测试(F类). 治疗效果显著(*P（P）*< 0.0001).

**图6。。*第9章*^−/−保护小鼠免受Ang II诱导的心脏纤维化。**
(A类)具有代表性的Masson三色染色野生型和*第9章*-用生理盐水或慢性Ang II输注治疗的小鼠的靶向心脏。比例尺：100µm。(B)ImageJ对三色载玻片上蓝色胶原的定量分析(n个=4至6）。(C类)心脏胶原蛋白含量*第9章*^−/−或用生理盐水（Sal）或Ang II治疗的野生型对照小鼠(n个=5至8）。(D类)各组小鼠心脏的代表性图像，如（A）所示，着色为SMA（红色）或DAPI（蓝色）。比例尺：100µm。(E类)野生型和*第9章*^−/−(*C9级*^−/−)接受Ang II输注的动物(n个=4至5）。(F类)Ang II治疗小鼠左心室功能的测量，包括射血分数和缩短分数(n个=5至8）。数据表示为平均值±s.e.m.，并对Ang II处理的野生型小鼠和所有其他条件进行统计比较。^纳秒*P（P）*> 0.05, **P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*Holm-Sidak单因素方差分析结果<0.001事后（post-hoc）测试(B,D类,F类)和Tukey的双向方差分析*事后（post-hoc）*测试(E类). 治疗效果显著(*P（P）*< 0.0001).

图7。 — **图7治疗剂量的MDL-28170改善了早期建立的肺纤维化。**
(A类)代表*第1a1列*盐水或博莱霉素治疗和治疗性载体或MDL给药（博莱霉素给药一周后）三周后小鼠肺的RNA-ISH切片。比例尺：500µm。(B)红色的量化*第1a1列*RNA-ISH染色(n个=14至15）。数据表示为平均值±标准误差。^纳秒*P（P）*> 0.05, **P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, †*P（P）*< 0.005, ‡*P（P）*Holm-Sidak单因素方差分析结果<0.001事后（post-hoc）测试。

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