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.2020年3月；77（6）：1153-1175。
doi:10.1007/s00018-019-03227-w。 Epub 2019年7月13日。

长链脂肪酸合成的3-酮酰基-CoA还原酶17β-HSD12对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

玛丽亚·查奇 1, 皮尔敏·施特劳斯 1, 安贾·邓克尔 1, 哈娜·纳瓦蒂洛娃 1 2, 娜塔萨·姆拉德诺维奇 1, 亚历克斯·奥德马特 三
附属公司

长链脂肪酸合成的3-酮酰基-CoA还原酶17β-HSD12对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

玛丽亚·查奇等。 细胞分子生命科学. 2020年3月.

摘要

肿瘤细胞的代谢重编程涉及脂肪酸（FA）合成的上调，以支持高生物能量需求和膜合成。这已被证明用于具有多达16个碳原子的FA的胞浆合成。长链脂肪酸（LCFAs）的合成，包括ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸，发生在内质网。尽管越来越多的证据表明LCFA在癌症中发挥着重要作用，但它们的合成对癌细胞生长的影响几乎没有研究。在这里，我们证明了沉默17β-羟基类固醇脱氢酶12型（17β-HSD12），本质上是催化LCFA生成中3-酮酰基-CoA还原步骤，以细胞系依赖的方式调节乳腺癌细胞的增殖和迁移。17β-HSD12敲除后增殖和迁移的增加部分由花生四烯酸向COX2和CYP1B1衍生二十烷酸的代谢介导。通过增加葡萄糖浓度来挽救增殖减少，之前通过氧化磷酸化和剩余呼吸能力减少ATP生成。此外，17β-HSD12沉默伴随着未折叠蛋白反应的改变，包括CHOP表达减少、eIF2α活化增加和折叠伴侣ERp44。我们的研究强调了LCFA生物合成对肿瘤细胞生理学的重要性，并揭示了乳腺癌细胞异质性的未知方面。

关键词：17β-羟甾脱氢酶；生物合成；癌症；内质网；长链脂肪酸；未折叠蛋白反应。

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图1
图1
17β-HSD12对癌细胞增殖的影响。一LCFA的每一轮伸长包括四个步骤。在第一步中，超长链脂肪酸（ELOVL1–7）的长链化合物与底物脂肪酰基-CoA缩合。随后，3-酮酰基-CoA还原酶（KAR或17β-HSD12）将3-酮酰基-CoA还原为3-羟基酰基-Co A，然后通过3-羟基酰基-Co A脱水酶（HACD1-4）脱水。最终还原步骤由2,3执行-反式-烯醇-CoA还原酶（TER）产生由两个碳原子拉长的脂肪酰基-CoA。b必需的PUFAs亚油酸和α-亚麻酸通过一系列伸长和/或去饱和反应，分别产生大量ω-6和ω-3 FAs。具有不同底物偏好的脂肪酸去饱和酶（FADS1和FADS2）和ELOVL（ELOVL2和ELOWL5）参与此代谢途径的不同步骤。ω-6 osbond酸（22:5）和ω-3二十二碳六烯酸（DHA，22:6）分别通过二十二碳四烯酸（DTA）和二十二碳五烯酸（DPA）的伸长和去饱和，然后在过氧化物酶体中β-氧化而生成。c（c）用模拟或17β-HSD12 siRNA转染MCF7、MDA-MB-453、SUM159和MDA-MB-231细胞或不处理（ctrl）。（左面板）使用xCELLigence RTCA DP仪器进行细胞增殖的实时测量。显示了三分之一独立实验的细胞指数值（四个技术重复的平均值和标准偏差）。对于SUM159细胞，将细胞指数归一化为5小时，以解释本实验中播种的微小差异。（右图）在siRNAs转染后24小时、48小时和72小时，用Hoechst-33342对细胞核进行染色，并通过高含量成像进行分析。这些值表示每个细胞系至少三个独立实验的平均值和误差条SD，并在每个时间点归一化为模拟siRNA样本(*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001,纳秒不重要）
图2
图2
17β-HSD12沉默对癌细胞迁移和粘附的影响。一用模拟或17β-HSD12 siRNAs转染MCF7、MDA-MB-453、SUM159和MDA-MB-231细胞后的跨西向迁移分析。显示了计数的迁移细胞的绝对值（平均值 ± SD、，n个 = 3, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01).b（顶部）在SUM159或MDA-MB-231细胞中17β-HSD12下调48小时后，用qPCR测定指示基因的相对mRNA水平（平均值 ± SD、，n个 = 4中*第页 < 0.05,纳秒不重要）（底部）。在模拟或17β-HSD12 siRNA转染的细胞中测试SUM159或MDA-MB-231细胞在有或没有纤连蛋白涂层的情况下粘附到平板上的能力（平均 ± SD、，n个 = 6,纳秒不重要）
图3
图3
SUM159和MDA-MB-231细胞中17β-HSD12下调后差异变化的可能决定因素。一（左图）SUM159细胞在含胰岛素的Ham’s F12营养混合物或含或不含胰岛素的RPMI 1640中培养。17β-HSD12的表达被siRNAs下调，72小时后测定细胞数量。（右图）生长在含胰岛素的Ham’s F12营养混合物或不含胰岛素的RPMI 1640中的SUM159细胞中17β-HSD12沉默后的跨周迁移分析。统计分析比较了每种情况下的模拟和17β-HSD12-siRNA样本（实线），以及不同培养条件下模拟17β-HSD 12-siRNA组之间的差异（虚线）（平均值 ± SD、，n个 = 3, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01,纳秒不重要）。b（左面板）与MDA-MB-231和SUM159细胞中指示基因的PPIA相关的mRNA表达。17β-HSD12下调后48 h，MDA-MB-231和SUM159细胞中elongase（ELOVL5和ELOVL7）和去饱和酶（FADS1和FADS2）基因的mRNA表达（中间和右侧面板）（平均值 ± SD、，n个 = 4中*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,纳秒不重要）。c（c）17β-HSD12下调48 h后，western blot分析MDA-MB-231和SUM159细胞中FADS1、FADS2和ELOVL5的表达。显示了至少三个独立实验（右侧面板）的代表性印迹（左侧面板）和带密度分析。将数值标准化为模拟siRNA样本（平均值 ± SD、*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,纳秒不重要）
图4
图4
脂肪酸参与17β-HSD12-敲除表型。在MDA-MB-231中(一)和SUM159(b)细胞，在敲低17β-HSD12并补充BSA或BSA缀合的DHA、EPA和AA后测定细胞数量。在沉默17β-HSD12表达并用BSA或BSA缀合的EPA和AA处理后，在反式阱分析中计数迁移的细胞数量。统计分析显示，比较了不同模拟和17β-HSD12 siRNA组之间的差异程度（平均值 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01,纳秒不重要）。c（c）17β-HSD12下调48小时后，测量MDA-MB-231细胞中PTGER2 mRNA的表达（平均值 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05). SUM159细胞中未检测到PTGER2的表达。在模拟或17β-HSD12-siRNA-转染细胞中，用二甲基亚砜或1μm辅酶-2抑制剂塞来昔布（CEL）处理后，评估MDA-MB-231和SUM159细胞的数量（平均值 ± SD、，n个 = 3, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001,纳秒不重要）。d日17β-HSD12沉默并用二甲基亚砜或CEL治疗后，评估MDA-MB-231细胞迁移的细胞数量（平均值 ± SD、，n个 = 3, *第页 < 0.05,纳秒不重要）。e（电子）MDA-MB-231和SUM159细胞中指示基因的mRNA水平（平均值 ± SD、，n个 = 4, ***第页 < 0.001,纳秒不重要）。如果用DMSO或CYP1B1抑制剂TMS和模拟或17β-HSD12 siRNA转染后MDA-MB-231细胞的细胞数量和迁移细胞（平均值 ± SD、，n个 = 3, *第页 < 0.05,纳秒不重要）。克（左图）模拟或17β-HSD12 siRNA转染的MDA-MB-231提取物中AA的量（ng/ml/mg蛋白质）(n个 = 3） 和SUM159电池(n个 = 4） ，用竞争ELISA测定法测定。（右侧面板）AA水平标准化为模拟siRNA样本（平均值 ± SD、*第页 < 0.05,纳秒不重要）
图5
图5
17β-HSD12沉默对耗氧量的影响。在SUM159和MDA-MB-231细胞中17β-HSD12下调48小时后，使用Seahorse XF96分析仪实时测量OCR。采用Seahorse XF Cell Mito应激试验计算线粒体功能的不同参数（基础呼吸、ATP生成、最大呼吸、剩余呼吸量和质子泄漏）以及非线粒体耗氧量。样品未经处理（ctrl）或用β-氧化抑制剂Eto（线粒体）或Thio（过氧化物酶体）处理。用蓝色字符描述的统计分析比较了相应的模拟siRNA和17β-HSD12 siRNA样品之间的值差异。其余以黑色字母显示的统计分析用于研究所示组之间的差异（平均值 ± SD、，n个 = 5, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001,纳秒不重要）
图6
图6
β-氧化和葡萄糖代谢对17β-HSD12沉默表型的影响。一模拟或17β-HSD12-siRNA转染后48小时和线粒体β-氧化抑制剂Eto治疗后24小时，MDA-MB-231细胞计数（顶部，n个 = 6） 或过氧化物酶体β-氧化硫（底部，n个 = 5） （平均值 ± SD、*第页 < 0.05,纳秒不重要）。b在图5所示的实验过程中，使用Seahorse XF96分析仪在基线时测量MDA-MB-231和SUM159细胞的ECAR ± SD、，n个 = 5, **第页 < 0.01,纳秒不重要）。蓝色字符所示的统计分析比较了相应模拟siRNA和17β-HSD12 siRNA样本之间的数值差异。c（c）MDA-MB-231中17β-HSD12敲除后的细胞计数(n个 = 4） 和SUM159(n个 = 5） 细胞和在含有4 g/l、2 g/l或0.5 g/l葡萄糖的RPMI 1640培养基中培养。虚线表示不同模拟siRNA/17β-HSD12 siRNA组之间的统计比较，而实线表示所示模拟siRNA和17β-HSD 12 siRNA样品之间的比较（平均值 ± SD、*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.01,纳秒不重要）。d日用western blot检测MDA-MB-231和SUM159细胞中G6PD的水平，并用密度测定法定量（平均值 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05,纳秒不重要）
图7
图7
17β-HSD12下调后eIF2α/ATF4途径的改变。一MDA-MB-231中17β-HSD12基因敲除后eIF2α和peIF2a蛋白表达的Western blot分析(n个 = 6） 和SUM159(n个 = 3） 单元格。显示了所有独立实验的代表性印迹和密度测定分析。根据eIF2α和peIF2的个体密度，计算eIF2 a磷酸化的速率（平均值 ± SD、*第页 < 0.05, **第页 < 0.01).b用模拟、eIF2α、17β-HSD12-或eIF2β和17β-HST12-siRNA转染MDA-MB-231和SUM159细胞，用qPCR检测17β-HSD 12mRNA水平（平均 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05, ***第页 < 0.001).c（c）MDA-MB-231型(n个 = 7） 和SUM159(n个 = 4） 如图7b所示处理细胞，并评估不同样品中的细胞数量（平均值 ± SD、*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001,纳秒不重要）。d日17β-HSD12下调48小时后，通过western blot检测MDA-MB-231和SUM159细胞中ATF4蛋白的表达（平均 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05,纳秒不重要）
图8
图8
17β-HSD12敲低对CHOP和ERp44表达的影响。一17β-HSD12沉默后48小时，用western blot检测SUM159细胞CHOP蛋白水平。17β-HSD12下调48小时后MDA-MB-231和SUM159细胞CHOP靶GADD34的mRNA表达（平均 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01).b17β-HSD12敲低48小时后RXRα蛋白在MDA-MB-231和SUM159细胞中的表达（平均 ± SD、，n个 = 4, *第页 < 0.05).c（c）用模拟、RXRα、17β-HSD12-或RXRβ-和17β-HSD 12-siRNA转染SUM159细胞，并用qPCR（平均 ± SD、，n个 = 5, *第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001,纳秒不重要）。d日在MDA-MB-231和SUM159细胞中17β-HSD12敲除后，通过western blot分析折叠蛋白ERp44的水平（平均值 ± SD、，n个 = 5, **第页 < 0.01***第页 < 0.001).e（电子）17β-HSD12敲除后在MDA-MB-231和SUM159细胞中观察到的最显著的细胞变化总结。（左面板）在SUM159细胞中，17β-HSD12下调导致增殖和迁移减少，这可以通过补充EPA来恢复。其他FA合成中的畸变还可能导致观察到的表型。在MDA-MB-231细胞中，17β-HSD12的敲除通过促进增殖和迁移的COX和CYPB1途径导致AA代谢增加。17β-HSD12敲除后的增殖增强由β-氧化提供的能量和/或构建块支持。（右图）17β-HSD12沉默后SUM159和MDA-MB-231细胞UPR/折叠和能量代谢变化的比较
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