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.2019年9月；23(9):5934-5948.
doi:10.1111/jcmm.14402。 Epub 2019年7月12日。

MicroRNA-539通过下调DLX1的TGF-β/Smad4信号通路在前列腺癌中发挥肿瘤抑制作用

孙宝刚 1, Yingying Fan公司 2, 杨爱军 1, 梁路南 1, 曹景和 1
附属公司

MicroRNA-539通过下调DLX1的TGF-β/Smad4信号通路在前列腺癌中发挥肿瘤抑制作用

孙宝刚等。 细胞与分子医学杂志. 2019年9月.

摘要

前列腺癌（PCa）是男性癌症相关死亡的第二大原因，主要是因为其转移潜能。本研究旨在确定microRNA-539（miR-539）在PCa中的表达，并进一步研究其在体内外PCa进展中的功能相关性。最初，进行微阵列分析以获得差异表达的候选基因和调节性miRNA，然后确定两者之间可能的相互作用。接下来，在PCa细胞中进行miR-539的异位表达和下调，以确定miR-538在PCa发病机制中的功能作用，然后测量E-cadherin、vimentin、Smad4、c-Myc、Snail1和SLUG的表达，以及PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。最后，通过体内实验评估肿瘤在裸鼠体内的生长情况。结果发现，PCa组织和细胞中miR-539表达下调，DLX1表达上调。miR-539还被发现靶向并负调控DLX1表达，从而抑制TGF-β/Smad4信号通路。此外，miR-539或DLX1基因沉默上调导致PCa细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和肿瘤生长受到抑制，同时E-cadherin表达增加，波形蛋白、Smad4、c-Myc、蜗牛1和SLUG表达降低。总之，miR-539-介导的DLX1抑制的过度表达可能通过阻断TGF-β/Smad4信号通路，阻止PCa细胞的EMT、增殖、迁移和侵袭，突显出治疗PCa的潜在miR-539/DLX1/TGF-β/Smad 4调控轴。

关键词：远端小于1；上皮-间充质转化；微小RNA-539；入侵；转移；前列腺癌；转化生长因子β/Smad4信号通路。

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未申报。

数字

图1
图1
基于微阵列的基因表达谱通过介导DLX1确定hsa‐miR‐539参与PCa的发展。A‐C，PCa相关基因表达谱的表达热图，其中横坐标表示样本数，纵坐标表示基因名称，上交叉带表示样本类型。蓝色代表正常对照样品，红色代表PCa样品。右直方图表示颜色等级，其中红色表示高表达，绿色表示低表达。上部树状图是指样本簇，左侧树状图则是指基因表达簇。每个圆圈代表一个样本中基因的表达；D、 对来自三个数据集的差异表达基因进行Venn分析，其中蓝色表示GSE55945数据集中差异表达基因的数量，红色表示GSE45016数据集差异表达基因数量，绿色表示GSE38241数据集中差异表示基因的数量。中间部分是三个数据集的交集，图像中的数字是每个区域中差异表达基因的数量；E、 TCGA数据库中PCa样本和正常对照样本中DLX1的表达，其中横坐标表示样本簇，纵坐标表示DLX1基因的表达，左侧蓝盒图是指正常对照样本中DLX1的表达，右侧红盒图是PCa样本中DLX1基因的表达；F、 预测的调控DLX1基因的miRNA，其中蓝色表示从mirDIP数据库预测的miRNAs，红色表示从starBase数据库预测的microRNA，绿色表示从microRNA.org数据库预测出的microRNAs和黄色表示从TargetScan数据库预测到的miRNA。编号为7的区域是四个数据库预测结果的交集，表明这四个数据库中同时存在七个miRNA*P（P）<0.05，与原发肿瘤组或正常组比较；前列腺癌；miR-539，microRNA‐539；转化生长因子-β；DLX1，无远端同源盒1；TCGA，癌症基因组图谱
图2
图2
DLX1蛋白在前列腺癌组织中的阳性表达增加。A、 前列腺癌组织及癌旁正常组织DLX1蛋白免疫组化染色分析；B、 定量分析DLX1蛋白在前列腺癌组织和邻近正常组织中的阳性表达率**P（P）与PCa组织或邻近正常组织相比<0.01；前列腺癌；DLX1，无远端同源盒1
图3
图3
PCa组织中miR‐539和E-cadherin的表达较差，而DLX1、Smad4、c-Myc、vimentin、Snail1和SLUG的表达较高。A、 RT-qPCR检测前列腺癌组织和邻近正常组织中DLX1、Smad4、c-Myc和波形蛋白、Snail1、SLUG和E-钙粘蛋白的miR-539表达和mRNA表达；B和C，PCa组织和邻近正常组织中DLX1、Smad4、C-Myc和vimentin、Snail1、SLUG和E-cadherin蛋白的Western blot分析*P（P）<0.05，与邻近正常组织相比；前列腺癌；miR‐539、微小RNA‐539；DLX1，无远端同源盒1；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应
图4
图4
DLX1是miR‐539的靶基因。A、 DLX1 3'-UTR上miR‐539的预测结合位点；B、 通过双荧光素酶报告基因分析检测NC和miR‐539模拟组中的荧光素酶活性*P（P）<0.05，与NC组相比；miR-539，microRNA‐539；DLX1，无远端同源盒1；NC，阴性对照；3′-UTR，3′-非翻译区；Wt，野生型；哑巴，突变体
图5
图5
miR‐539促进E-钙粘蛋白的表达，并抑制DLX1、波形蛋白、c-Myc、Smad4、Snail1和SLUG的表达。A、 RT-qPCR检测转染miR-539模拟物、miR-539inhibitor、si-DLX1和miR-539-inhibitor+si-DLX1的PC3细胞系中DLX1、vimentin、E-cadherin、c-Myc、Smad4、Snail1和SLUG的mRNA表达；B、 RT-qPCR检测转染miR-539模拟物、miR-539inhibitor、si-DLX1和miR-539-inhibitor+si-DLX1的DU145细胞系中DLX1、vimentin、E-cadherin、c-Myc、Smad4、Snail1和SLUG的mRNA表达；C和E，转染miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si‐DLX1和miR‐）抑制剂+si‐DLX1的PC3细胞系中DLX1、vimentin、E-cadherin、C‐Myc、Smad4、Snail1和SLUG蛋白的Western blot分析；D和F，转染miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si‐DLX1和miR‐）抑制剂+si‐DLX1的DU145细胞系中DLX1、vimentin、E-cadherin、c‐Myc、Smad4、Snail1和SLUG蛋白的Western blot分析*P（P）<0.05，与空白组和NC组相比；miR-539，microRNA‐539；DLX1，无远端同源盒1；NC，阴性对照；si，小干扰；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应
图6
图6
miR‐539上调或DLX1沉默抑制PCa细胞活性。A、 MTT法测定PC3细胞对miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si-DLX1和miR-539inhibitor+si‐DLX1的活性；B、 MTT法测定DU145细胞对miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si-DLX1和miR-539inhibitor+si‐DLX1的活性*P（P）<0.05，与空白组和NC组相比；前列腺癌；miR-539，microRNA‐539；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵；OD，光密度；NC，阴性对照；si，小干扰
图7
图7
miR‐539上调或DLX1沉默抑制PCa细胞迁移。A和C，PC3细胞迁移和通过划痕试验测量的miR‐539模拟物、miR‐）539抑制剂、si‐DLX1和miR‐》539抑制剂+si‐DBX1的定量分析；B和D，DU145细胞迁移和通过划痕试验测量的miR‐539模拟物、miR­539抑制剂、si‐DLX1和miR‐）539抑制剂+si‐DBX1的定量分析*P（P）<0.05，与空白组和NC组相比；miR-539，microRNA‐539；前列腺癌；NC，阴性对照；si，小干扰
图8
图8
miR‐539上调或DLX1沉默抑制PCa细胞侵袭。A、 转染miR-539模拟物、miR‐539抑制剂、si‐DLX1和miR‐）539抑制剂+si‐DLX1的PC3细胞系和DU145细胞系的侵袭性（×200）；B、 定量分析转染miR-539模拟物、miR‐539抑制剂、si-DLX1和miR‐）539抑制剂+si-DLX1的侵袭性PC3细胞的数量；C、 定量分析转染miR-539模拟物、miR‐539抑制剂、si-DLX1和miR‐）539抑制剂+si-DLX1的侵袭性DU145细胞的数量*P（P）与空白组和NC组相比均<0.05；miR-539，microRNA‐539；前列腺癌；NC，阴性对照；si，小干扰
图9
图9
上调miR‐539或沉默DLX1可抑制裸鼠肿瘤生长。A和B，异种移植瘤和裸鼠注射PC3细胞后对miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si‐DLX1和miR-539inhibitor+si-DLX1的肿瘤质量定量分析；C和D，异种移植瘤和裸鼠注射DU145细胞后对miR‐539模拟物、miR-539抑制剂、si‐DLX1和miR-539inhibitor+si-DLX1的肿瘤质量定量分析*P（P）<0.05，与空白组和NC组相比；前列腺癌；miR-539，microRNA‐539；NC，阴性对照；si，小干扰
图10
图10
miR‐539的上调通过抑制TGF‐β信号通路阻碍PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。A、 MTT法测定转染SB‐431542、miR‐539抑制剂、DMSO、miR­539抑制因子+DMSO和miR‐）539抑制剂+SB‐的DU145细胞的增殖；B、 用SB‐431542、miR‐539抑制剂、DMSO、miR‐539抑制剂+DMSO和miR‐539抑制剂+SB‐431542转染的DU145细胞的迁移，通过划痕试验测量，C，用SB‐431542、miR‐539抑制剂、DMSO和miR‐539抑制剂+SB‐431542转染的DU145细胞的侵袭，通过transwell测定测量；D、 转染SB‐431542、miR‐539抑制剂、DMSO、miR­539抑制因子+DMSO和miR‐的DU145细胞系中波形蛋白、E-cadherin、c-Myc、Smad4、Snail1和SLUG蛋白的Western blot分析*P（P）与DMSO组相比，<0.05#P（P）<0.05，与miR‐539抑制剂+二甲基亚砜组相比
图11
图11
miR‐539对EMT和PCa转移的抑制作用示意图。miR‐539可以下调DLX1的表达，从而提高E-cadherin的表达，但降低DLX1、vimentin、c-Myc和Smad4的表达。这些改变导致PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长受到抑制。miR-539，microRNA‐539；前列腺癌；DLX1，无远端同源盒1；EMT，上皮-间充质转化
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