Activation of Rod Input in a Model of Retinal Degeneration Reverses Retinal Remodeling and Induces Formation of Functional Synapses and Recovery of Visual Signaling in the Adult Retina

doi:10.1523/JNEUROSCI.2902-18.2019

.2019年8月21日；39(34):6798-6810.

doi:10.1523/JNEUROSCI.2902-18.2019。 Epub 2019年7月8日。

视网膜变性模型中杆输入的激活逆转视网膜重塑并诱导功能性突触的形成和成年视网膜视觉信号的恢复

田旺¹, 约翰·帕尔伯格², 乔恩·卡法罗^三, 里卡德·弗雷德里克森², A J库珀¹, Alapakkam P Sampath公司⁴, 格雷格·D·菲尔德⁵, 珍妮·陈¹

附属公司

¹Zilkha神经遗传研究所，加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院生理学和神经科学系，邮编：90089。
²加州大学洛杉矶分校斯坦因眼科研究所眼科，加利福尼亚州90095，和。
^三北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院神经生物学系，邮编：27710。
⁴加州大学洛杉矶分校斯坦因眼科研究所眼科，加利福尼亚州90095asampath@jsei.ucla.edu field@neuro.duke.edu。
⁵北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院神经生物学系，27710asampath@jsei.ucla.edu field@neuro.duke.edu。

PMID： 31285302
预防性维修识别码： PMC6703885型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.2902-18.2019

视网膜退化模型中杆输入的激活逆转视网膜重塑，诱导成年视网膜功能突触的形成和视觉信号的恢复

田旺等。神经科学. 2019.

.2019年8月21日；39(34):6798-6810.

doi:10.1523/JNEUROSCI.2902-18.2019。 Epub 2019年7月8日。

作者

田旺¹, 约翰·帕尔伯格², 乔恩·卡法罗^三, 里卡德·弗雷德里克森², A J库珀¹, Alapakkam P Sampath公司⁴, 格雷格·D·菲尔德⁵, 珍妮·陈¹

附属公司

¹Zilkha神经遗传研究所，加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院生理学和神经科学系，邮编：90089。
²加州大学洛杉矶分校斯坦因眼科研究所眼科，加利福尼亚州90095，和。
^三北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院神经生物学系，邮编：27710。
⁴加州大学洛杉矶分校斯坦因眼科研究所眼科，加利福尼亚州90095asampath@jsei.ucla.edu field@neuro.duke.edu。
⁵北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院神经生物学系，27710asampath@jsei.ucla.edu field@neuro.duke.edu。

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摘要

导致人类失明的一个主要原因是光感受器棒的死亡。随着杆退化，杆和杆双极细胞之间的突触结构消失，杆双极性细胞延伸树突，偶尔会发生异常接触。这种变化广泛见于由感光细胞死亡引起的致盲性疾病，并被认为是对耳聋的反应。重建的视网膜回路如何影响视杆抢救后的视觉处理尚不清楚。为了解决这个问题，我们培育了雄性和雌性转基因小鼠，其中一个被破坏的cGMP门控通道（CNG）基因可以通过三苯氧胺诱导的cre-mediated重组在内源性位点和不同退化阶段修复。在正常的杆状体中，光诱导的CNG通道关闭导致细胞超极化，减少突触处神经递质的释放。同样，与WT棒相比，缺乏CNG通道的棒表现出约10 mV超极化的静息膜电位，表明谷氨酸释放减少。这些小鼠的视网膜由于视杆功能失常和退化而经历了典型的视网膜重塑。在三苯氧胺诱导CNG通道表达后，杆状物恢复了其结构并表现出正常的光反应。此外，我们发现成年小鼠视网膜在激活杆输入后显示出惊人的可塑性。曲折的双极细胞树突与杆建立接触，以支持正常的突触传递，并传播到视网膜神经节细胞。这些发现表明，在发育期之后，可塑性显著增强，支持了因视杆退化而失明的患者修复或更换缺陷视杆的努力。重要性声明目前治疗神经退行性疾病的策略主要集中在修复原发性受累细胞类型。然而，有缺陷的神经元在复杂的神经回路中发挥作用，在疾病期间也会退化。目前尚不清楚获救的神经元和改造后的电路是否会建立通信以恢复正常功能。我们发现，成年哺乳动物的神经视网膜在挽救视杆感光器后表现出惊人的可塑性。杆状双极细胞的任性树突与杆状体重新建立联系，以支持正常的突触传递，并传播到视网膜神经节细胞。这些发现支持了因杆细胞丢失而失明的患者修复或更换缺陷杆的努力。

关键词：基因治疗；神经可塑性；神经传递；感光细胞死亡；视网膜回路；视网膜变性。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
视网膜来自*Cngb1号机组^新/新*小鼠表现出典型的退行性改变。A类，1.8 kb的新霉素盒，两侧有loxP位点，被插入*Cngb1号机组*基因。B类、对照组和*Cngb1号机组^新/新*小鼠显示新霉素插入阻断了CNGB1的表达，并下调了CNGA1通道蛋白的表达。C类，代表性视网膜切片的光显微照片*Cngb1号机组^新/新*指定年龄的小鼠。比例尺，20μm。***D–I***，来自1 MO C57的冷冻（左）和*Cngb1号机组^新/新*小鼠（右）视紫红质（Rho）和GFAP染色。细胞核用DAPI染色（蓝色）。***H（H）***、C57和(我)*Cngb1号机组^新/新*视网膜切片对感光细胞的突触带（CtBP2，蓝色）和双极细胞树突的mGluR6点（红色）进行染色。C57的典型透射电子显微照片(J型)和*Cngb1号机组^新/新*(***K（K）***)视网膜切片。含有突触三联体的杆状球体用红色星号标记。突变视网膜中可见含有膜物质和液泡（箭头所示）的营养不良球体。R：棒核，C：椎弓根。OS，外段；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。

**图2。**
棒和棒双极函数的表征体外ERG。用药物性突触传递抑制剂分离出杆驱动的a波（见材料和方法），然后通过从整个ERG中减去a波得到杆双极主导的b波。A类，典型C57视网膜和两个1 MO的记录示例*Cngb1号机组^新/新*视网膜a波和b波分离。所有系列的闪光强度在0.10至40000光子·μm之间²，为了清楚起见，省略了非响应和过饱和响应。B类，孤立a波和衍生b波的响应强度关系。绘制为平均值±SEM的点。A波和b波数据由Hill方程拟合，指数固定为1。C57 a波拟合产生*R（右）*_最大值520μV和我_1/275光子·μm²，使用*Cngb1号机组^新/新*a波拟合产生*R（右）*_最大值140μV和I_1/21030光子·μm².C57 b波拟合产生了*R（右）*_最大值1070μV和我_1/25.8个光子·μm²，使用*Cngb1号机组^新/新*b波拟合产生*R（右）*_最大值420μV和我_1/2930光子·μm²。虚线包含在我_1/2每个值与光强轴相匹配，以便比较b波与a波的较大相对脱敏。

**图3。**
切除漂浮的新霉素盒可恢复CNG通道的表达并挽救杆细胞死亡。A类PCR引物1、2和3设计用于检测是否存在neoloxP盒。从4周开始，用三苯氧胺（TM）对Littermate小鼠进行指定天数的治疗，并在8周时从小鼠中提取视网膜DNA。控制视网膜DNA“c”来自于一只生殖系感染小鼠，其中所有组织中的neoloxP盒都已被移除(*Cngb1号机组*Δ*CaM公司*).B类、从4周龄开始连续4天用TM或载体（玉米油）治疗的指定年龄（6周、8周）的cre-negated和cre-regated同窝小鼠视网膜匀浆的Western blots。C类，从小鼠对侧眼制备的视网膜匀浆的Western blot用于A类.3 MO阴性代表性视网膜形态和外段结构(天,E类)或是阳性的室友(F类,***G公司***)从4周开始，用三苯氧胺连续治疗小鼠7天。外核层厚度的量化(***H（H）***)和外段长度(我)穿过视网膜中央经线，沿上下轴20个位置（平均值±SD，n个=4（对于阳性）；n个=5（对于阴性小鼠）。学生的位置显示出显著差异t吨测试标记为*第页<0.05和**第页< 0.01. 5 MO cre阴性的视网膜形态(J型)和cre-positive(***K（K）***)从第28页开始，用三苯氧胺连续治疗窝友4天。***L（左）***,体内来自他莫昔芬的ERGCngb1号机组^新/新老鼠(n个=3，个体小鼠为浅灰色、深灰色和黑色），在三苯氧胺治疗指定天数后记录。显示的痕迹来自单个老鼠对1 mcd闪光的反应。***M（M）***，b波值汇总（平均值±SD）***L（左）***.实心圆圈表示tamoxifen-fed的数据*控制面板1^新/新*小鼠和开环代表年龄匹配的C57对照组的值。

**图4。**
表达CNGB1后，光敏度提高。A类，单细胞记录显示*Cngb1号机组^新/新*可能反射由CNGA1单体组成的残留CNG通道的小鼠。闪光产生79、160、310、630和1300 Rh*/棒。B类，三苯氧胺治疗后，杆状反应的振幅和敏感性与C57相似；闪光强度为9、17、34、68、140、270和540 Rh*/棒。C类，单细胞记录的响应强度关系显示WT（黑点）和*Cngb1号机组^新/新*[红点；我_½数值为27±4(n个=5）和360±8(n个分别=9）]。重新引入CNGB1[蓝点；我_½= 43 ± 3 (n个= 10)].

**图5。**
CNGB1的表达逆转突触前和突触后视网膜重塑*Cngb1号机组^新/新*视网膜。所示为N=7个独立实验的代表性图像。A类–C类，左侧，1个MO C57、1个MO的视网膜平面支架*Cngb1号机组^新/新*，获救3名MOCngb1号机组分别从4周龄开始用三苯氧胺治疗连续7天的小鼠。扁平支架用突触前带状标记CtBP2（蓝色）和突触后标记mGluR6（橙色）染色。使用锥形止动蛋白ARR3（绿色）观察椎弓根。右图，与平板坐骑基因型相同的小鼠的视网膜横截面。视网膜切片用mGluR6抗体（红色）和杆状双极细胞标记物PKCα（teal）染色。天，代表TEMCngb1号机组救出了老鼠。含有突触元件的杆状球体用红色星号标记。E类，突触三联体和二联体以及C57中营养不良球体的量化，*Cngb1号机组^新/新*、和*Cngb1号机组*救出的老鼠(n个=每组3个）。每个独立样本用不同的颜色标记，每个点代表一个TEM图像场中计算的突触结构数量，标准化为外丛状层的10μm距离。在C57视网膜的图像中未观察到营养不良结构。数值为平均值±标准偏差。首先通过单向方差分析和Tukey HSD对各组进行比较。

**图6。**
视网膜切片中棒状双极细胞的生理反应。A类,体外3到6 MO的ERG b波响应*Cngb1号机组^新/新*三苯氧胺治疗后的Cre+小鼠。闪光产生0.33、1.1、4.0、20、72和240光子·μm⁻²请与图2进行比较A类电压钳杆双极电池记录(*V（V）*_米=−60 mV）(B类)C57棒双极电池（2–3 MO）；(C类)*Cngb1号机组^新/新*杆状双极细胞（1MO）；(天)*Cngb1号机组*三苯氧胺处理（3 MO）。C57棒型双极电池产生的闪光为2、4、8、16、31、62和130 Rh*/棒，而C57棒双极电池的闪光为280、560、1100和2200 Rh*/棒*Cngb1号机组^新/新*棒双极电池。在*Cngb1号机组^新/新*杆状双极细胞（5个视网膜上有15个细胞；闪光产生2200 Rh*/杆）。E类平均数据的响应强度关系表明，在获救的小鼠中，这种关系转移到较高的闪光强度，反映出一些杆损失。电极恢复后，电极双极细胞的Hill指数与正常值相似（Hill指数=1.6±0.05；n个=12），支持恢复正常的杆-杆双极细胞突触结构和谷氨酸释放暗速率。

**图7。**
全安装视网膜中RGC的暗闪光反应表明，早期杆抢救后已恢复。***A类₁***–***C类₁***，三个样本细胞在一次微弱闪光（0.75 Rh*/棒）下80–100次试验的峰值时间。***A类₂***–***C类₂***，PSTH用于三次日益明亮的暗淡闪烁（0.002、0.02、0.75、Rh*/棒）。***A类_三***–***C类_三***，每次试验在PSTH峰值周围100 ms窗口内测量的平均峰值速率±SD。根据这些曲线估算了1954个电池的暗闪阈值。平均累积分布函数在*Cngb1号机组^新/新*小鼠RGC比*Cngb1号机组*Δ*CaM公司*和三苯氧胺治疗*Cngb1号机组^新/新*小鼠RGC(天). 阴影区域显示了3-4种实验制剂的平均值标准误差（SEM）。此外，闪光阈值无法在来自*控制面板1^新/新*老鼠(E类). *第页<0.01，ns，不显著。

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