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.2019年7月8日：e46327。
doi:10.7554/eLife.46327。

通过基因与超增强子的接近性鉴定RBPMS作为哺乳动物平滑肌主剪接调控因子

Erick E Nakagaki-Silva公司 1, 克莱尔·古丁 1, 米里亚姆·洛里安 1 2, 艾什瓦娅·雅各布 1 三, 弗雷德里克·理查兹 1, 阿德里安·巴克罗伊德 1, 桑杰·辛哈 1 三, 克里斯托弗·W·J·史密斯 1
附属公司

通过基因与超增强子的接近性鉴定RBPMS作为哺乳动物平滑肌主剪接调控因子

Erick E Nakagaki-Silva公司等。 埃利夫. .

摘要

选择性剪接（AS）程序主要由调节性RNA-结合蛋白（RBP）控制。有人提出，少数主剪接调控因子可能控制细胞特异性剪接网络，这些RBP可以通过其基因与转录超增强子的接近性来识别。使用这种方法，我们确定RBPMS是分化血管平滑肌细胞（SMCs）中的关键剪接调控因子。RBPMS在SMCs从收缩表型转换为运动和增殖表型的过程中高度下调，并在该转换过程中负责20%的AS变化。RBPMS直接调节肌动蛋白细胞骨架和局灶粘附机制的许多成分的AS，其活性对两种表型的SMC功能都至关重要。RBPMS还调节包括关键SMC转录因子Myocardin在内的其他剪接、转录后和转录调控因子的剪接，从而匹配SMC中AS主调控因子的许多标准。

关键词：RNA结合蛋白；选择性拼接；染色体；基因表达；大鼠；平滑肌；超级增强器。

简明扼要的语言总结

我们身体中的所有细胞都包含相同的遗传信息，但它们只会启动它们在生物体中发挥特定作用所需的基因。被称为增强子的基因序列可以启动特定细胞执行其任务所需的基因。一旦一个基因被激活，它的序列就会忠实地复制到RNA分子中，RNA分子中包含编码蛋白质的片段。然后分子机器处理RNA分子并将编码片段拼接在一起。RNA结合蛋白也可以调节这种机制，并有助于根据细胞类型以不同的方式剪接编码片段。这一过程称为选择性RNA剪接，因此从同一基因中创建不同的RNA模板。这产生了相关但不同的蛋白质，每种蛋白质都适合制造它们的特定细胞的需要。然而，在某些细胞类型中，这是如何发生的还没有很好的记录。例如，在血管排列的细胞（称为血管平滑肌细胞）中，驱动选择性剪接的RNA结合蛋白尚未被确定。为了找到这些蛋白质，Nakagaki-Silva等人使用称为超增强子的DNA区域目录作为线索。这些序列以组织特异的方式强烈激活某些基因，有效地作为对特定细胞类型重要的基因的标签。在血管平滑肌细胞中，如果一个超级增强器启动一个编码RNA结合蛋白的基因，该蛋白可能对细胞正常工作至关重要。该方法强调了一种称为RBPMS的蛋白质，并表明它控制着许多在平滑肌细胞中重要的基因的选择性RNA剪接。这可能表明，当RBPMS调节被破坏时，可能会出现某些心脏和血管疾病。最后，Nakagaki-Silva等人的结果表明，超增强子可以标记在特定细胞类型中调控剪接或其他关键过程中重要的基因。

PubMed免责声明

利益冲突声明

EN、CG、ML、AJ、FR、AB、SS、CS未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.RBPMS与SMC超增强子相关，并且在分化的PAC1细胞中高度表达。
(A类)SMC脱分化图。分化和去分化的SMC标记分别显示在图的底部和顶部。(B类)RBP基因在不同人类平滑肌组织中与超增强子相关的文氏图。骨骼肌被用作异常值。左侧显示了所有平滑肌组织（骨骼肌除外）共有的RBP。(C类)确定两种主要RBPMS亚型的AS事件示意图，即RBPMS A（红色）和RBPMS B（黄色）。(天)SMC剪接标记的RT-PCR分析，行动1和传输时间1在分化的（D）和增殖的（P）PAC1细胞中。顶部受调控的互斥剪接事件示意图和左侧各异构体产品示意图。所示值为平滑肌亚型（SM）的定量PSI（拼接百分比）±标准偏差(n个 = 3). (E类)qRT-PCR分析卢比（所有异构体），卢比2和SMC分化标记学报2,Cnn1号机组和Smtn公司，在PAC1细胞D（绿色）和P（蓝色）中。表达被标准化为两名管家的平均值(Gapdh公司和32卢比)并显示了相对表达式的平均值(n个 = 3). 每个点显示单个样本的数据。使用Student t检验进行统计学显著性检验（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。(F类)D和P PAC1细胞中RBPMS的蛋白质印迹。ACTA2是SMC分化标记，GAPDH是负荷控制。A和B表示两种RBPMS亚型。(G公司)RBPMS的D和P PAC1细胞免疫荧光。细胞核DAPI染色。
图1——图补充1。
图1-补充图1。RBPMS在SM组织中高度表达。
(A类)RBPMS公司GTEX数据库中不同人体组织的mRNA表达（GTEX Consortium，2013）。TPM：百万分之几的成绩单。
图1—图补充2。
图1-图补充2..大鼠主动脉SMC去分化RNA-Seq的mRNA丰度分析。
(A类)大鼠主动脉组织脱分化实验设计示意图。(B类)分化主动脉组织（T）和增殖通道9（P9）中RBP基因的mRNA丰度。发现其基因与平滑肌组织超增强子相关的RBP（图1B）以绿色突出显示。此外，其他特征明确的RBP和卢比2标签是黑色的。LOC108348175号是乐队注释的老鼠吗Qki公司类似基因。通过DESeq2计算T和P9之间mRNA丰度变化的统计显著性，并以深灰色和浅灰色表示（padj分别<0.05和无显著性变化）。mRNA水平以百万分之转录物（TPM）表示。Cpsf4l公司此数据集中未找到该基因。(C类)大鼠主动脉脱分化过程中以百万分转录物（TPM）测量的mRNA丰度变化（T、SC、P0和P9）。显示的基因有卢比和它的paralogRbpms2型SMC分化标记，学报2,Cnn1型和Smtn公司和其他限制性商业惯例，百万英镑1,第1部分和问题1.
图1——图补充3。
图1-图补充3：大鼠主动脉SMC去分化RNA-Seq的选择性剪接分析。
(A类)比较T和P9条件时，AS发生变化。仅显示FDR<0.05且ΔPSI大于10%的显著ASE。ASE被分为跳过外显子（SE）、互斥外显子、5’和3’选择性剪接位点（A5SS和A3SS）和保留内含子（RI）。图中显示了差异交替拼接的事件数。(B类)在T和P9比较中，受mRNA丰度和AS水平影响的基因数量重叠。(C类)SMC互斥剪接标记的刺身图，行动1和传输时间1，在大鼠主动脉组织脱分化中。PSI值表示由rMATS计算的PSI值的平均值。(天)T和P9比较中差异选择性剪接SE中的RBPMS基序富集。一对由1到12 nt分隔的CAC被用作RBPMS基序。值表示图案丰富。使用Matt工具计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图2。
图2 RBPMS调节PAC1细胞中的AS。
(A类)PAC1细胞中RBPMS敲除和过度表达的实验设计示意图。(B类)PAC1敲除中RBPMS的蛋白质印迹，左，和诱导慢病毒过度表达，右。FLAG抗体也用于3xFLAG标记的RBPMS的过度表达。GAPDH和TUBULIN被用作加载控制。(C类)PAC1去分化、RBPMS敲除、中间和RBPMS A过度表达中mRNA丰度变化的MA图（左）。深灰色：基因发生显著变化（p-adj<0.05）。浅灰色：p-adj≥0.05的基因。红色：Rbpms（相对湿度）,卢比2和SMC标记，行动2。上调和下调的数量显示在顶部和底部。水平线；log2倍数变化=1和−1。(天)左侧PAC1细胞脱分化、RBPMS敲除、中间和右侧RBPMS A过度表达的AS变化（FDR<0.05和ΔPSI大于10%）。用rMATS将ASE分为跳跃外显子（SE）、互斥外显子、选择性5′和3′剪接位点（A5SS和A3SS）和保留内含子（RI）。数字表示所比较条件之间每个事件类型的有效ASE数。(E类)选定ASE的刺身图。Ptprf公司显示为一个分化的盒外显子（绿色），压电陶瓷1作为增殖盒外显子（蓝色）和行动1作为MXE。拱上的数字表示外显子-外显子连接的读数。ASE的PSI值针对每种情况显示。数值对应于rMATS计算的平均PSI。如果是行动1MXE，显示SM外显子的包含百分比（PSI-SM）。选择性剪接产生的mRNA亚型示意图和染色体坐标见底部。(F类)面板E中ASE的RT-PCR验证。所示值为PSI±标准偏差的平均值(n个 = 3). 使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。更多经RT-PCR验证的RBPMS敲除和RBPMS A过度表达中的ASE，请参见图2补充图3。
图2——图补充1。
图2-图补充1。PAC1 RNAseq样本的主成分分析以及在剪接和丰度水平上调节的基因重叠。
(A类)基于RBPMS敲除（D-Ctr和D-KD）和过度表达（P-Ctr与P-OE）重复的mRNA丰度方差的主成分分析（PCA）。(B类)rMATS检测到的不同AS类型的示意图。(C类)在PAC1去分化和RBPMS敲除和过度表达比较中，受mRNA丰度和AS水平影响的基因数量重叠。
图2——图补充2。
图2补充图2。SM基因的AS变化对RBPMS表达是特异的。
(A类)多西环素治疗后慢病毒对照人群（P LV）中缺乏调控剪接的验证。(B类)验证第二个RBPMS siRNA（KD2，隐形siRNAs，Thermo Fisher Scientific（RSS363829）：CGCUUCGAUCGAAAUCCCGCAAA）。Western blot检测用其中一种siRNA处理的分化PAC1细胞中的RBPMS。在蛋白质印迹中使用GAPDH作为负载对照。提取RNA并进行RT-PCR以验证先前针对KD1的ASE特征。在(A类)和(B类)，所示值为PSI的平均值±sd（n=3）。使用Student t检验计算统计学显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图2——补充图3。
图2-图补充3.通过RT-PCR和RNA-Seq测定的ΔPSI值显示出良好的一致性。
(A类)通过RT-PCR验证RBPMS敲除和过度表达的分化增殖盒和互斥剪接事件。示意图表示PCR产物对应的剪接亚型。所示值为PSI的平均值±sd（n=3）。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。(B类)RBPMS敲除和过度表达RNAseq实验的rMATS分析中估计的ΔPSI与RBPMS实验的RT-PCR验证中观察到的ΔPS之间的PSI相关性（n=28）。黑线表示线性回归模型。为了获得统计显著性，在RStudio中进行了皮尔逊相关检验，结果显示在图的右角。r2是相关系数，p值表示相关性的统计显著性。
图3。
图3 RBPMS概述了分化PAC1和主动脉组织的AS程序。
(A类)PAC1去分化、RBPMS敲除和RBPMS A过表达比较中确定的显著ASE的维恩图（FDR<0.05和ΔPSI截止值10%）。(B类)PAC1细胞去分化和RBPMS敲除的重叠ASE的ΔPSI相关性（FDR<0.05和ΔPSI10%的截止值），左侧或RBPMS A过度表达，右侧。该线表示线性回归模型。采用皮尔逊相关检验进行统计显著性检验。n是评估的ASE数量，r2是相关系数。相关性的统计显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(C类)在RBPMS敲除、过度表达和主动脉组织中发现的显著ASE的文氏图，以通过九个比较。(天)大鼠主动脉组织去分化和RBPMS敲除重叠ASE的ΔPSI相关性，左侧或RBPMS A过度表达，右侧。(E类)PAC1脱分化比较中调节的289个SE的热图（D Ctr-P Ctr）。每列代表来自RBPMS敲除（D-Ctr和D-KD）或过度表达（P-Ctr与P-OE）的复制样本（1-3）。行是PAC1去分化的重要SE事件。行和列按层次聚类进行分组。Z分数缩放行中的蓝色和绿色分别代表低PSI值和高PSI值。(F类)大鼠主动脉组织去分化比较（T-P9）中调节的590个SE的热图。每列代表主动脉组织脱分化（T和P9）、RBPMS敲除（D-Ctr和D-KD）或RBPMS过度表达（P-Ctr与P-OE）中的一个样本。行是T-P9比较中的重要SE事件。行和列按层次聚类进行分组。Z分数缩放行中的蓝色和绿色分别代表低PSI值和高PSI值。(G公司)选定ASE的刺身图在主动脉组织中高度调节，RBPMS过度表达。费尔姆2是F组簇1中RBPMS激活的外显子。Tsc2型是E组簇4的RBPMS抑制外显子。校准1具有RBPMS激活的外显子4和外显子3b上的下游五个剪接位点。对于Cald1，括号中手动计算的PSI考虑了rMATS注释中未包含的A5SS。
图3——图补充1。
图3——图补充1。RBPMS概述了主动脉组织AS模式Vcl公司,传输时间1和校准1.
(A类)刺身阴谋Vcl公司主动脉组织脱分化过程中的盒外显子调控（FDR<4×10−14)RBPMS过度表达（FDR<1.2×10−12). PSI值表示通过rMATS分析计算的PSI值的平均值。(B类)刺身阴谋传输时间1互斥外显子在主动脉组织脱分化和RBPMS过度表达期间调节。PSI值表示通过对SM外显子2进行rMATS分析计算的PSI值的平均值。(C类)RT-PCR验证校准1增殖性PAC1细胞中RBPMS过度表达的ASE（A5SS和SE）。的示意图校准1ASE和校准1PCR扩增的亚型分别显示在顶部和左侧。(天)CALD1的Western blot探针显示RBPMS过度表达时出现h-CALD1蛋白亚型。亚型开关的特异性也在小家鼠来自主动脉组织的分化（D0）和增殖（D7）SMC样品。h-CALD1表示CALD1的较大平滑肌特异性亚型。所示值为PSI的平均值±sd（n=3）。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图4。
图4.RBPMS直接调节与CAC基序相关的外显子。
(A类)RBPMS图案（CACN1-12PAC1脱分化（D-Ctr-P-Ctr）、RBPMS敲除（D-Ctro-DKD）和RBPMS过表达（P-OE-P-Ctrs）比较中差异选择性剪接盒外显子的CAC富集。值表示基序富集（黑色）或缺失（红色）的程度。统计显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(B类)RBPMS图案（CACN1-12CAC）图谱（P OE-P Ctr）。显示上调（绿色）、下调（蓝色）和未调控（灰色）盒外显子。统计学意义：p<0.05，1000个排列以较粗的线宽表示。(C类)RBPMS在HEK293细胞中的过度表达和内源性RT-PCRFLNB公司外显子H1剪接。的示意图Flnb公司外显子H1是RBPMS激活的一个分化盒外显子。的拼接模式FLNB公司对Venus标记的RBPMS A、B和2的过度表达进行了测试。模拟和金星控制也进行了并行测试。(天)RBPMS过度表达对大鼠的影响Flnb公司HEK293细胞中的剪接报告子。的示意图Flnb公司报告人和RT-PCR的剪接模式Flnb公司报告RBPMS亚型和RBPMS2共表达。(E类)Flnb公司对点突变破坏RBPMS基序（CAC到CCC）的报告者进行RBPMS A调控测试。左、野生型报告子和右、突变型CAC报告子（mCAC）RT-PCR。(F类)重组RBPMS A和B与体外转录野生型和mCAC RNA体外结合的电动迁移率变化分析（EMSA）Flnb公司外显子H1下游内含子序列（左上和右上）。下面板：相同样品的UV交联。(G公司)RBPMS在HEK293细胞中的过度表达和内源性RT-PCR胎压监测1MXE外显子2和3剪接。的拼接模式胎压监测1对Venus标记的RBPMS A、B和2的过度表达进行了测试。模拟和金星控制也进行了并行测试。(H（H）)RBPMS过度表达对大鼠的影响传输时间1HEK293细胞中的剪接报告子。的示意图Tpm1型报告人和RT-PCR的剪接模式传输时间1RBPMS亚型和旁系的报告子。(我)传输时间1对点突变破坏RBPMS基序（CAC到CCC）的报告者进行RBPMS A调控测试。左侧，野生型报告子和右侧，突变CAC报告子（mCAC）RT聚合酶链式反应。(J型)重组RBPMS A和B与体外转录野生型和mCAC RNA的体外结合传输时间1外显子3上游内含子序列。EMSA，顶部和UV交联，底部。在(F类)和(J型)在0.125至2μM的范围内，使用连续稀释（1:4）的重组蛋白进行体外结合试验。在面板中(C–E类)和(G–I型)，值为平均PSI±sd(n个 = 3). 对于Flnb公司盒外显子，PSI是A5SS事件产生的短亚型和长亚型的总和。对于传输时间1MXE，显示SM外显子PSI（PSI-SM）。剪接亚型的示意图表明PCR产物是分化的（绿色）和增殖的（蓝色）。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。进行Western blot抗GFP和GAPDH负荷对照，以评估HEK293中RBPMS亚型的过度表达（面板(C-E、H、I). 西方的污点(C类)也是(G公司)，因为两个RT-PCR(FLNB公司和胎压监测1)来自相同的过度表达实验。
图4——图补充1。
图4-图补遗1.RBPMS促进了MPRIP公司和行动1在HEK293细胞中。
(A类)内源性RT-PCR验证MPRIP公司和行动1ASE对HEK293细胞中RBPMS亚型和RBPMS2过度表达的影响。的示意图MPRIP公司SE和行动1MXE位于顶部。(B类)潜在RBPMS CAC基序上游示意图行动1外显子NM和(C类)的下游Flnb公司外显子H1。
图4——图补充2。
图4图补遗2。RBPMS抑制行动1和传输时间1.
(A类)行动1HEK293细胞中RBPMS过度表达剪接。行动1包含SM和NM外显子或仅包含SM或NM外隐子的报告者在RBPMS过度表达时进行测试。不同的示意图行动1测试的拼接记者显示在顶部。Western blot检测GFP和GAPDH作为负荷对照，以验证RBPMS过度表达。(B类)在中映射RBPMS cis元素传输时间1外显子三剪接报告子。第三外显子上游的潜在RBPMS CAC基序在顶部的示意图中突出显示。对不同CAC突变组合在HEK293细胞中的RBPMS A过度表达进行测试。通过western blot探针检测GFP（Venus）和GAPDH的过度表达作为负荷对照。尽管PSI不同于仅报告人的通道，但在标记为“*”的通道中未检测到过度表达。在(A类)和(B类)，剪接亚型示意图确定PCR产物，所示值为PSI的平均值±sd（n=3）。如果是MXE，则显示SM外显子内含物。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图4——补充图3。
图4补充图3。RBPMS剪接活性需要RNA结合和二聚体。
(A类)RBPMS亚型A示意图，结合和二聚突变体中的残基发生突变。(B类)免疫印迹检测GFP评估HEK293细胞中RBPMS亚型和突变体的过度表达。GAPDH被用作负荷控制。(C类)RBPMS剪接靶标的RT-PCR(传输时间1小基因与内源性FLNB公司,行动1和MPRIP公司)在HEK293细胞中过度表达野生型RBPMS亚型和RBPMS A突变体。示意图表示PCR产物对应的剪接亚型。所示数值为PSI（n=3）的平均值±sd。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图4——补充图4。
图4——图4补充了4..RBPMS重组蛋白。
(A类)RBPMS A和B重组蛋白。纯化的重组RBPMS A和B在20%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行分析。同时进行BSA滴定以定量重组蛋白。(B类)重组蛋白序列经RBPMS和FLAG的western blot检测证实。
图5。
图5 RBPMS调节SMC中的重要功能目标。
(A类)RBPMS敲除中带盒外显子调控基因的GO分析。显示了三类（生物过程、分子功能和细胞成分）中前五个富集GO项。条内和条前的值表示富集项中的基因数量以及相对于背景列表的富集。(B类)在与平滑肌组织中的超增强子相关的基因中，由RBPMS敲除调节的外显子的富集。背景集是rMATS在同一实验中检测到的所有盒外显子事件（调控和非调控）。显著性由超几何P值决定。(C类)在RBPMS敲除和PAC1分化状态下显示一致剪接调控的基因的PPI网络，与RBPMS过度表达和主动脉组织数据集中一致调控的基因相结合。使用实验和数据库作为交互源，在STRING中生成PPI网络。网络边缘表示交互可信度。分析中还包括丰富的GO术语（BP、生物过程、MF、分子功能和CC、细胞成分），并用红色、蓝色和黄色表示。根据在1、2或3 SMC组织中是否为超增强相关基因，与超增强相关的基因名称以粗体显示，并突出显示为灰色、浅绿色或深绿色阴影。(天)分化和增殖PAC1细胞（D和P）中RBPMS和肌动蛋白（磷灰石）的免疫荧光，以及分化PAC1细胞中长时间（120小时）RBPMS击倒后的免疫荧光（D-Ctr和D-KD）。细胞核DAPI染色。比例尺10μm。(E类)左，使用FibrilTool ImageJ宏（n=44和52）测量PAC1细胞D（分化）和P（增殖）中肌动蛋白纤维的各向异性。中间，以像素表示的细胞核大小测量（n=182和130）。对，每个字段量化的单元格大小的平均值（n=11和15）。(F类)左侧，使用FibrilTool ImageJ宏（n=56和33）测量RBPMS敲除（D Ctr和D KD）中肌动蛋白纤维的各向异性。中间，以像素表示的细胞核大小测量（n=363和75）。右，每个场量化的细胞大小的平均值（n=14和10）。在(E类)和(F类)，通过Mann-Whitney-Whilcoxon试验得出统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。所示数据来自一个代表性实验，一式三份。
图5——图补充1。
图5补充1。RBPMS过度表达和PAC1及主动脉脱分化差异拼接基因的GO分析。
来自差异剪接基因的大猩猩GO分析的前五个富集GO术语。(A类)增殖性PAC1细胞中RBPMS过度表达。(B类)PAC1脱分化。(C类)大鼠主动脉组织脱分化。条内和条前的值表示富集项中的基因数量以及相对于背景列表的富集。
图5——图补充2。
图5补充图2。PAC1细胞的形态变化与RBPMS敲除有关。
(A类)仅用第二个siRNA（KD3，隐形siRNAs，Thermo Fisher Scientific（RSS363830）：CAG UAC UCC UCU GCC CAA CAC UGU a）处理的PAC1细胞中RBPMS和ACTIN（磷脂酶原）的免疫荧光，并在120小时siRNA处理后与siRNA1结合（KD1和3–45 pmol）。细胞核DAPI染色。比例尺10μm。(B类)左侧，使用FibrilTool ImageJ宏（分别为n=56、33、26、33）测量RBPMS敲除（C、K1、K3和K1和3）中ACTIN纤维的各向异性。中间，以像素表示的细胞核大小测量值（分别为n=363、75、82、93）。对，每个字段量化的单元格大小的平均值（n=14,10,7,10）。通过Mann-Whitney-Whilcoxon试验得出统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。所示数据来自一个代表性实验，一式三份。
图5——补充图3。
图5补充图3。PAC1细胞中RBPMS持续敲除。
(A类)Western blot显示120小时siRNA处理后PAC1细胞中RBPMS下调（对照组（C）、siRNA1（KD1）、siRNA 3（KD3）、siRNA1和3（KD1和3））。靶向ACTA2（SMC分化标记）和GAPDH的抗体被用作负荷控制。(B类)qRT-PCR分析卢比（所有亚型）和SMC分化标记学报2，在击倒中（对照（C），siRNA1（KD1），siRNA 3（KD3），siRNA1和3（KD1和3））。相对表达被标准化为两名管家的平均值(Gapdh公司和32卢比)并显示了相对表达式的平均值(n个 = 3). 每个点显示单个样本的数据。中的更改学报2不显著。(C类)RBPMS剪接靶的RT-PCR分析行动1和Ptprf公司120小时RBPMS KD后PAC1细胞中。左侧受管制的同种型产品示意图。所示值为平滑肌亚型（SM）的定量PSI（拼接百分比）。数据来自一个代表性实验，一式三份。使用Student t检验评估统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
图6。
图6 RBPMS调节转录后调控因子的剪接。
(A类)刺身阴谋Mbnl1型受调控的外显子。拱形顶部的数字表示外显子-外显子连接的读数。为每个外显子（外显子7–36 bp和外显子8–95 bp）计算的PSI值的平均值显示了每个条件（PSI-ex7和PSI-ex8）。底部是不同mRNA亚型的示意图。(B类)Mbnl1外显子7和8的RT-PCR验证(C类)Mbnl 2号机组。所示值为PSI±标准偏差的平均值(n个 = 3). 显示了Mbnl1每个外显子的PSI值。对于姆布尔2RT-PCR中未检测到外显子7亚型。剪接亚型的示意图识别PCR产物。(天)对RBPMS敲除和过度表达中MBNL1和2的Western blot检测表明，MBNL1亚型在蛋白质水平上发生了转换。(E类)不同MBNL1蛋白亚型示意图，左侧。不同的MBNL1和MBNL2亚型在HEK293T细胞中过度表达，它们对A5SS事件的影响NCOR2号机组基因评估。的示意图NCOR2号机组剪接异构体表示PCR产物。针对FLAG进行Western blot检测，以验证亚型过度表达。PSI表示使用下游A5SS生成更长的亚型。(F类)MBNL1和2在可诱导的RBPMS A或慢病毒控制（P LV）增殖的PAC1细胞中的敲除，以评估Ncor2号机组MBNL1亚型开关的A5SS事件。MBNL1和2的蛋白质印迹和FLAG，以证实MBNL敲低和RBPMS A过表达。在所有的western blots中，TUBULIN被用作加载控制。使用Student t检验计算统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。(G公司)刺身情节Lsm14b型盒外显子受RBPMS调控。PSI值表示通过rMATS分析计算的PSI值的平均值。(H（H）)RT-PCR验证Lsm14b型在PAC1细胞中RBPMS敲除和过度表达。的示意图Lsm14b型事件位于顶部，其异构体示意图位于左侧。外显子编码的肽序列如下图所示。(我)RBPMS敲除和过度表达细胞中LSM14B的Western blot。GAPDH用于装载控制。
图7。
图7 RBPMS控制SMC转录因子的剪接Myocd公司外显子2a。
(A类)的示意图Myocd公司外显子2a ASE及其对MYOCD蛋白结构域的功能影响。(B类)的RT-PCRMyocd公司PAC1分化（D）和增殖（P）PAC1细胞中的外显子2a剪接（左）和用对照（D-Ctr）或RBPMS siRNAs（D-KD）处理的分化PAC1细胞（右）。(C类)的示意图Myocd公司外显子2a剪接报告子。外显子2a下游发现的CAC基序的两个主要簇以红色突出显示(天)RBPMS A和B过度表达对Myocd公司PAC1细胞的外显子2a。只对记者和金星控制装置进行了测试。蛋白质表达水平显示在GFP和GAPDH的western blot检测中，作为负荷控制。(E类)RT-PCR研究RBPMS A和B过度表达对HEK293中Myocd外显子2a剪接报告子的影响。RBPMS CAC位点发生突变，并通过RT-PCR验证对RBPMS的反应。不同突变体Myocd外显子2a剪接报告子的示意图位于顶部。使用GAPDH作为负荷对照，通过western blot证实RBPMS过度表达。(F类)在EMSA（顶部）和UV-交联（底部）中，RBPMS A和B与Myocd外显子2a下游内含子序列的体外结合。体外转录的野生型和不同的mCAC RNA与重组RBPMS（0.125至2μM）一起孵育。(G公司)PAR-CLIP（Farazi等人，2014）确定与RBPMS结合的UBE2V1序列被插入mCAC Myocd报告子。mCAC Myocd外显子2a剪接报告子和UBE2V1序列示意图。RBPMS A和B过表达对HEK293细胞中Myocd报告基因的影响的RT-PCR。Western blot检测GFP和GAPDH作为负荷控制。(H（H）)RBPMS和QKI共同表达对HEK293中Myocd外显子2a阻遏物Myocd 2a报告子的影响。Myocd 2a报告者示意图，显示了QKI和潜在的RBPMS结合位点。通过针对GFP和GAPDH的western blot证实RBPMS和QKI过度表达，作为负荷控制。在GFP western blots中，“*”表示剪接报告子的GFP产物。
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