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.2019年12月；13(1):249-259.
doi:10.1080/19336918.2019.1638690。

BECN1通过调节波形蛋白的泛素化促进非小细胞肺癌细胞的迁移

程朱军（Zhujun Cheng） 1 2 三, 洪博欣 三, 天宇韩 1
附属公司

BECN1通过调节波形蛋白的泛素化促进非小细胞肺癌细胞的迁移

程朱军（Zhujun Cheng）等。 细胞Adh Migr. 2019年12月.

摘要

BECN1/Beclin1是自噬调控的关键蛋白之一。然而，BECN1在非小细胞肺癌（NSCLC）中的生物学功能尚不清楚。在这里，我们发现BECN1敲除或过度表达都不会影响NSCLC细胞的增殖。令人惊讶的是，BECN1过度表达增加了细胞迁移，而敲低BECN1则显著降低了NSCLC细胞的迁移能力。我们进一步证明BECN1可以与波形蛋白相互作用并影响其K48连接的泛素化。此外，BECN1还可以与泛素特异性肽酶14（USP14）相互作用，USP14是Vimentin的关键去泛素酶，调控USP14介导的Vimentin去泛素化。因此，我们的研究揭示了BECN1通过调节波形蛋白的泛素化在非小细胞肺癌细胞迁移中的肿瘤支持作用。

关键词：BECN1；非小细胞肺癌；波形蛋白；迁移；无处不在。

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数字

图1。
图1。
BECN1基因敲除对非小细胞肺癌细胞的增殖没有显著影响（a）用BECN1特异性siRNA转染H1299细胞。20小时后，进行细胞生长试验。在指定的时间，用4%甲醛固定细胞，然后用2%结晶紫染色。染料最终用10%乙酸溶解，并通过595nm处的吸光度测定相对增殖。数据表示三个独立实验的平均值。纳秒，P>（P）0.05（左侧面板）。使用抗BECN1抗体通过Western blot测定靶向BECN1的siRNAs的敲除效率（右面板）。（b） 将BECN1 siRNAs转染H1299细胞24 h，进行集落形成实验。10天后，用4%甲醛固定细胞，然后用2%结晶紫染色。对菌落进行拍照（左侧面板）。用10%乙酸溶解染料，并通过595nm处的吸光度测定菌落形成的定量。数据表示三个独立实验的平均值。纳秒，P>（P）0.05（右侧面板）。（c） 用BECN1 siRNAs转染A549细胞。20小时后，进行细胞生长试验。在指定的时间，用4%甲醛固定细胞，然后用2%结晶紫染色。染料最终用10%乙酸溶解，并通过595nm处的吸光度测定相对增殖。数据表示三个独立实验的平均值。纳秒，P＞0.05（左侧面板）。使用抗BECN1抗体通过Western blot测定靶向BECN1的siRNAs的敲除效率（右面板）。（d） 将BECN1 siRNAs转染A549细胞24 h，进行集落形成实验。10天后，用4%甲醛固定细胞，然后用2%结晶紫染色。对菌落进行拍照（左侧面板）。用10%乙酸溶解染料，并通过595nm处的吸光度测定菌落形成的定量。数据表示三个独立实验的平均值。纳秒，P>（P）0.05（右侧面板）。
图2。
图2。
细胞周期进程不受BECN1表达的影响（a）用pCMV-HA或pCMV-HA-BECN1转染H1299细胞。48小时后，收集细胞并通过流式细胞仪进行分析（左面板）。从左侧面板得出的细胞周期每个阶段的细胞数量用不同颜色标记[红色：静止期和第一间隙期（G0/G1期），绿色：DNA合成期（S期），蓝色：第二间隙期和有丝分裂期（G2/M期）]（右侧面板）。（b） 用Q-PCR检测H1299细胞中细胞周期相关基因的mRNA水平。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。***，P（P）≤ 0.001; 纳秒，P>（P）0.05. （c） 使用转染BECN1 siRNAs的H1299细胞中的指示抗体，通过Western blot测定细胞周期相关基因的蛋白水平。
图3。
图3。
BECN1的表达影响非小细胞肺癌细胞的迁移能力（a）用BECN1 siRNAs转染H1299细胞，并进行伤口愈合试验。照片拍摄于0和12小时（左侧面板）。通过测量实验前缘和起始边缘之间的面积差异来量化细胞迁移。伤口面积由ImageJ软件评估。**，P（P）≤0.01（右侧面板）。（b） 通过特异性siRNAs敲除H1299细胞中的BECN1，并进行跨阱分析。18小时后，将迁移的细胞固定并用2%结晶紫染色。照片是在100倍放大的条件下拍摄的（左侧面板）。用10%乙酸溶解染料，并通过595nm处的吸光度测定细胞迁移的定量。数据表示三个独立实验的平均值。***，P（P）≤0.001（右侧面板）。
图4。
图4。
稳定击倒BECN1的H1299细胞显示迁移能力降低（a）使用稳定击倒BECN1的H1299细胞进行软琼脂试验。两周后，在40倍放大率下拍摄照片。比例尺：200μm（左侧面板）。对大于50μM的菌落进行评分。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。纳秒，P>（P）0.05（右侧面板）。（b） 使用稳定击倒BECN1的H1299细胞进行Transwell分析。将迁移的细胞固定并用2%结晶紫染色。这些照片是在放大100倍的条件下拍摄的。（左侧面板）。用10%乙酸溶解染料，并通过595nm处的吸光度测定细胞迁移的定量。数据表示三个独立实验的平均值。**，P（P）≤0.01（右侧面板）。（c） 用荧光Phalloidin和DAPI对BECN1敲除的H1299稳定细胞系进行染色。使用荧光显微镜在200倍放大率下拍摄照片。白色箭头表示丝状体。比例尺：50μm。
图5。
图5。
BECN1影响波形蛋白的泛素化和表达（a）用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，进行Western blot检测指示蛋白的表达。（b） 用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，提取总RNA。Q-PCR检测相关基因的mRNA水平。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。***，P（P）≤ 0.001; 纳秒，P＞0.05. （c） 用BECN1 siRNAs转染H1299细胞。48小时后，通过Western blot检测所示蛋白。（d） 用BECN1 siRNA转染H1299细胞。48小时后，提取总RNA。Q-PCR检测相关基因的mRNA水平。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。***，P（P）≤ 0.001; 纳秒，P>（P）0.05. （e） 用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，使用小鼠抗HA抗体免疫沉淀HA-BECN1，然后进行Western blot。用兔抗波形蛋白抗体检测波形蛋白，用兔抗HA抗体检测HA-BECN1。（f） 用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，使用小鼠抗波形蛋白抗体免疫沉淀内源性波形蛋白。Western blot检测指示蛋白的表达。使用K48链特异性多泛素抗体检测K48链泛素化。用兔抗波形蛋白抗体检测波形蛋白。（g） 用BECN1 siRNAs转染H1299细胞。48小时后，使用小鼠抗波形蛋白抗体免疫沉淀内源性波形蛋白。Western blot检测指示蛋白的表达。使用K48链特异性多泛素抗体检测K48链泛素化。用兔抗波形蛋白抗体检测波形蛋白。
图6。
图6。
USP14对波形蛋白的去泛素依赖于BECN1的表达（a）用pCMV-HA-USP14质粒转染H1299细胞。48小时后，用兔抗HA抗体免疫沉淀HA-USP14，然后进行Western blot。用小鼠抗BECN1抗体检测BECN1，用小鼠抗HA抗体检测HA-USP14。（b） 用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，使用小鼠抗HA抗体免疫沉淀HA-BECN1，然后进行Western blot。用兔抗USP14抗体检测USP14，用兔抗HA抗体检测HA-BECN1。（c） 用pCMV-HA-BECN1质粒转染H1299细胞。48小时后，使用正常兔IgG和兔抗USP14抗体进行免疫沉淀，然后进行Western blot。使用小鼠抗USP14抗体检测USP14，使用小鼠抗Vimentin抗体检测Vimentin。（d） 将BECN1特异性siRNA转染H1299细胞，48小时后，用正常兔IgG和兔抗USP14抗体进行免疫沉淀，然后进行Western blot。使用小鼠抗USP14抗体检测USP14，使用小鼠抗Vimentin抗体检测Vimentin。（e） 将pCMV-HA-USP14单独转染H1299细胞，或与pCMV-HA-USP14和pCMV-HA-BECN1联合转染。48小时后，使用小鼠抗波形蛋白抗体进行免疫沉淀。使用K48连接特异性多泛素抗体检测K48连接的泛素化。用兔抗波形蛋白抗体检测波形蛋白。（f） 将pCMV-HA-USP14单独转染H1299细胞，或与pCMV-HA-USP14和BECN1 siRNA联合转染。48小时后，用小鼠抗Vimentin抗体进行免疫沉淀。使用K48连接特异性多泛素抗体检测K48连接的泛素化。用兔抗波形蛋白抗体检测波形蛋白。
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这项工作得到了南昌大学第一附属医院博士创业基金的支持。