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.2019年7月2日；9(1):9562.
doi:10.1038/s41598-019-45872-y。

延迟脑室内注射TLR7激动剂对早产儿窒息后脑白质和灰质的保护作用

肯塔·H·T·乔 1, 吉多·瓦辛克 1, 罗伯特·加林斯基 1 2, 徐冰（Bing Xu） 1 三, 萨姆·马泰 1, Simerdeep K Dhillon公司 1, 洛特·范登·海伊 1, 乔安妮·O·戴维森 1, 卢克·韦弗·米凯雷 1, 劳拉·本内特 1, 阿利斯泰尔·冈恩 1, 姆霍伊拉·弗雷泽 4
附属公司

延迟脑室内注射TLR7激动剂对早产儿窒息后脑白质和灰质的保护作用

肯塔·H·T·乔等。 科学代表. .

摘要

早产儿脑损伤与炎症密切相关，炎症可能部分与缺氧缺血的无菌反应有关。我们最近发现，未成熟大脑中炎症预处理的神经保护与toll样受体7（TLR7）的诱导有关。因此，我们验证了以下假设：在早产等效胎羊严重缺氧缺血后，中央给药合成TLR7激动剂加德奎莫德（GDQ）可以改善白质和灰质的恢复。妊娠0.7岁时的胎羊接受假窒息或脐带阻塞引起的窒息25分钟，然后在侧脑室持续灌注GDQ或载体1至4小时（总剂量1.8 mg/kg）。窒息72小时后处死绵羊进行组织学检查。GDQ显著提高了未成熟和成熟少突胶质细胞（2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶，CNPase）和总少突胶质细胞（少突胶质细胞转录因子2，Olig-2）在心室周围和锥体内白质内的存活率。两个白质区域的细胞数量减少，显示裂解caspase-3阳性凋亡和星形胶质细胞增生（胶质纤维酸性蛋白，GFAP）。齿状回、尾状核和丘脑内侧核的神经元存活率增加。中央输注GDQ与胎儿血浆中抗炎细胞因子干扰素-β（IFN-β）和白细胞介素-10（IL-10）浓度的显著增加相关，而促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度没有显著变化。总之，在发育中的大脑出现严重缺氧缺血后，延迟给予TLR7激动剂GDQ可显著改善白质和灰质损伤，并与抗炎细胞因子的上调相关。这些数据有力地支持了这样一种假设，即调节继发性炎症可能是早产儿脑损伤的可行治疗靶点。

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数字

图1
图1
胎儿血浆I型IFN-β和IL-10的抗炎细胞因子浓度与GDQ治疗后显著增加。假闭塞、闭塞和闭塞中TNF-α（ng/ml）、IFN-β（pg/ml）和IL-10（ng/ml）浓度的顺序变化 + GDQ动物从窒息开始的时间表示为(A类–C类)分别是。虚线表示脐带阻塞的持续时间。数据以平均值表示 ± 扫描电镜（SEM）：IFN-β评估的时间点数量略有不同；这是由于有足够的样本。干扰素-β：4 小时，¼闭塞 + GDQ与假闭塞和闭塞p < 0.01之间。白介素-10：6 小时 + 24 小时，¼闭塞 + GDQ与假闭塞和闭塞p < 0.001.
图2
图2
GDQ治疗与脑室周围白质（PVWM）和脑回内白质（IGWM）区域内少突胶质细胞系细胞总数的保存增加相关。CNPase免疫组化的代表性显微照片(A类–C类)，寡核苷酸-2(D类–F类)和裂解的胱天蛋白酶-3(G公司–我)假闭塞、闭塞和闭塞的PVWM内 + GDQ组72 窒息后小时。IGWM区域的代表性图像未显示。假闭塞胎儿的大脑在PVWM内表现出密集的CNPAse免疫反应(A类)和IGWM。在闭塞组，CNPase阳性的未成熟/成熟少突胶质细胞的细胞数量减少，同时胞体放射出的突起消失(B类)而GDQ处理的胎儿的细胞和过程都恢复了(C类). Olig-2免疫反应的视觉评估证实了假咬合之间细胞群的类似显著差异(D类)，遮挡(E类)和遮挡 + GDQ组(F类). 在闭塞组，检测到PVWM caspase-3免疫阳性细胞(H（H）). 放大倍数×40。比例尺 = 50 微米。
图3
图3
通过GDQ治疗，PVWM和IGWM中少突胶质细胞的细胞密度恢复。这些数字描述了GDQ的ICV管理对(A类)CNPase（未成熟和成熟）和(B类)寡聚-2（总）少突胶质细胞和(C类)72天后PVWM和IGWM中caspase-3免疫阳性细胞裂解 从25小时恢复 脐带阻塞分钟（窒息）。手机号码平均 ± 扫描电镜(A类)PVWM：*p < 0.001与假闭塞，#对 < 0.001与遮挡。IGWM:*p < 0.001：与假闭塞相比；#对 < 0.002：对比遮挡。(B类)PVWM公司 + IGWM:*p < 0.001 vs.假闭塞；#对 < 0.001与遮挡。(C类)PVWM公司 + IGWM:*p < 0.001 vs.假闭塞；#对 < 0.001相对于闭塞。
图4
图4
所有遮挡组（遮挡和遮挡）的相关性分析 + 寡核苷酸-2和裂解半胱天冬酶-3细胞数量之间的GDQ显示，PVWM（R2 = 0.36便士 < 0.03）和IGWM（R2 = 0.45，便士 < 0.01). 虚线是95%置信区间。红色圆圈：PVWM遮挡 + GDQ；半红圈：PVWM闭塞；蓝色圆圈：IGWM闭塞 + GDQ；半蓝色圆圈：IGWM遮挡。
图5
图5
GDQ治疗与白质内细胞增殖增加和少突胶质细胞增殖能力恢复相关。假闭塞PVWM中增殖标记Ki-67的免疫组化典型显微照片(A类)，遮挡(B类)和遮挡 + GDQ公司(C类) 72 窒息后小时。数据描述了GDQ对PVWM和IGWM中Ki-67阳性细胞密度的影响（D，#对 < 0.001相对于假闭塞和闭塞）。Olig-2（绿色）和Ki-67（红色）双重免疫荧光标记显示GDQ治疗后PVWM区Olig-2阳性细胞的增殖反应(E类)与假闭塞没有区别(F类)而在闭塞组则有所减少(G公司). 深蓝色代表DAPI核复染。箭头表示Olig-2/Ki-67阳性染色。数据描述了GDQ对PVWM和IGWM内Olig-2/Ki-67阳性细胞密度的影响(H（H）). PVWM:*p < 0.008 vs.假闭塞，IGWM:*p < 0.002 vs.假闭塞。放大倍率x 40。比例尺 = 50 微米。手机号码平均 ± 扫描电镜。
图6
图6
GDQ治疗与星形胶质细胞密度降低和增殖有关。假闭塞PVWM内星形胶质细胞标志物GFAP免疫组化的代表性显微照片(A类)，遮挡(B类)和遮挡 + GDQ组(C类) 72 窒息后小时。数据描述了ICV注射GDQ对PVWM和IGWM中GFAP阳性细胞密度的影响(D类). PVWM:*p < 0.001与假闭塞，#对 < 0.001相对于闭塞。IGWM:*p < 0.001 vs.假闭塞；#对 < 0.006 vs.闭塞。GFAP（绿色）和Ki-67（红色）双重免疫荧光标记显示闭塞组PVWM区域内增殖的星形胶质细胞显著增加(E类)与假闭塞相比(F类)和遮挡 + GDQ组(G公司). 深蓝色代表DAPI核复染。箭头表示GFAP/Ki-67阳性染色。数据描述了ICV给药GDQ对PVWM和IGWM内GFAP/Ki-67阳性细胞密度的影响(H（H）). PVWM公司 + IGWM:*p < 0.001相对于假闭塞，#对 < 0.001与遮挡。放大倍率x 40。比例尺 = 50 微米。手机号码平均 ± 扫描电镜。
图7
图7
GDQ引起的小胶质细胞激活与M2样极化增强相一致。假闭塞PVWM内小胶质细胞标记物Iba-1免疫组化的代表性显微照片(A类)，遮挡(B类)和遮挡 + GDQ公司(C类) 72 窒息后数小时。数据描述了GDQ对PVWM和IGWM中Iba-1-阳性细胞密度的影响(D类). PVWM公司 + IGWM:*p < 0.001与假闭塞，#对 < 0.001与遮挡。Iba-1（绿色）和Ki-67（红色）的双重免疫荧光标记显示闭塞PVWM内增殖的小胶质细胞显著增加 + GDQ公司(G公司)与假闭塞相比(E类)和遮挡(F类). 深蓝色代表DAPI核复染。数据描述了GDQ对PVWM和IGWM内Iba-1/Ki-67阳性细胞密度的影响(H（H）). PVWM公司 + IGWM:*p < 0.001与假闭塞，#对 < 0.001与遮挡。CD163和Iba-1切片的免疫标记显示闭塞时呈阳性反应 + GDQ公司(我)与假闭塞相比(J)和遮挡(K（K）). 数据表示对两个白质区域内表达CD163的变形虫Iba-1阳性小胶质细胞相对百分比的定量分析（L，#P（P） < 0.001 vs.假闭塞和闭塞）。放大倍数×40。比例尺 = 50 微米。手机号码平均 ± 扫描电镜。
图8
图8
GDQ对海马和特定皮层下区域神经元密度和caspase-3激活的影响。神经元（NeuN-阳性细胞(A类–我)和凋亡细胞（裂解的caspase-3阳性细胞(K（K）–S公司)，位于纹状体尾状核（NeuN:A类–C类，半胱天冬酶-3：K（K）–M（M）)，齿状回（DG，NeuN：D类–F类，半胱天冬酶-3：N个–P（P）)海马和丘脑内侧核（MN，NeuN：G公司–我，半胱天冬酶-3：问–S公司)假咬合、咬合和咬合 + GDQ 72号 窒息后小时。数据显示GDQ对神经元密度的影响(J)和caspase-3阳性细胞(T型)在尾状核、壳核、海马区CA1/2、CA3、CA4和DG、丘脑MN和内侧膝状体核（MGN）内。神经节：尾核：*p < 0.02 vs.假闭塞，#对 < 0.04与遮挡。CA1/2:*p < 0.001 vs.假闭塞。CA3*p < 0.001 vs.假闭塞。CA4:*p < 0.01 vs.假闭塞。危险品：*p < 0.001 vs.假闭塞，p < 0.002 vs.闭塞。MN:*p < 0.002 vs.假闭塞，#对 < 0.02与遮挡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3:*p < 0.005 vs.假闭塞；#对 < 0.005 vs.闭塞。放大倍数×40。比例尺 = 50 微米。手机号码平均 ± 扫描电镜。
图9
图9
海马体和皮层下区域的细胞增殖。神经元标记物NeuN（绿色）和增殖标记物Ki-67（红色）的代表性免疫组织化学显微照片显示，齿状回（DG，A类–C类)和丘脑内侧核(D类–F类)在两个遮挡中 + GDQ公司(A类,D类)、和遮挡(C类,F类)与假闭塞相比(B类,E类). DG:*p < 0.001闭塞与假闭塞，*p < 0.01闭塞 + GDQ与假闭塞。MN:*p < 0.002闭塞与假闭塞，p < 0.01闭塞 + GDQ与假闭塞。放大倍数×40。比例尺 = 50 微米。手机号码平均 ± 扫描电镜。
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参考文献

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