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.2019年7月;18(1):389-396.
doi:10.3892/etm.2019.7527。 Epub 2019年4月24日。

MicroRNA-18通过靶向NAV1促进胰岛β细胞凋亡

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MicroRNA-18通过靶向NAV1促进胰岛β细胞凋亡

洪华飞等。 实验治疗学. 2019年7月.

摘要

糖尿病(DM)的详细发病机制尚待完全阐明。本研究旨在探讨microRNA(miR)-18在糖尿病中的作用及其潜在机制,为糖尿病的治疗提供新思路。在炎症因子介导的诱导后,通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测胰岛β细胞系MIN6中miR-18的表达。然后构建miR-18模拟物和miR-18抑制剂并转染到MIN6细胞。用RT-qPCR检测MIN6细胞中胰岛素原mRNA水平。通过ELISA和葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定分别测定MIN6细胞的释放胰岛素水平和胰岛素分泌功能。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法和凋亡蛋白的western blot分析检测MIN6细胞的凋亡。miR-18与神经元导航子1(NAV1)(磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT通路的组成部分)的结合作用通过双核糖核酸酶报告基因分析进行评估。最后,通过western blot分析确定miR-18对PI3K/AKT通路的调节作用。在MIN6细胞中诱导炎症因子后,miR-18的表达显著上调。miR-18模拟物转染抑制了胰岛素原水平以及胰岛素生成和分泌能力。miR-18基因敲除部分消除了白细胞介素-1β(IL-1β)治疗诱导的抑制胰岛素分泌能力。此外,miR-18模拟物增加了MIN6细胞的凋亡。双核糖核酸酶报告基因分析证实miR-18与NAV1直接结合。Western blot分析表明miR-18显著抑制MIN6细胞的PI3K/AKT通路。总之,胰岛β细胞中的miR-18表达受IL-1β诱导上调。研究表明,miR-18通过抑制PI3K/AKT通路抑制NAV1表达和胰岛素生成,至少部分促进胰岛β细胞凋亡。

关键词:糖尿病;炎症;微小RNA-18;神经元导航器1;磷脂酰肌醇3-激酶/AKT途径。

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数字

图1。
图1。
炎症因子促进胰岛β细胞中miR-18的表达。(A) 细胞因子诱导的MIN6细胞中miR-18的表达显著升高。(B) 通过IL-1β、TNF-α和IFN-γ或其联合诱导,miR-18水平上调。(C) miR-18模拟物和抑制剂在MIN6细胞中的上调或下调作用*与对照组相比,P<0.05。miR,microRNA;IL、白细胞介素;干扰素;肿瘤坏死因子;NC,阴性对照;Cyt混合物,细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-γ的混合物。
图2。
图2。
miR-18抑制胰岛β细胞产生胰岛素。(A) 逆转录定量聚合酶链反应分析表明,miR-18模拟物导致MIN6细胞中的前胰岛素水平下调。(B) ELISA检测到miR-18模拟物导致释放的胰岛素水平降低。(C) miR-18基因敲除部分消除了IL-1β诱导的前胰岛素水平下降。(D) 葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验表明miR-18对胰岛素分泌的抑制作用。(E) IL-1β诱导的MIN6细胞中被抑制的胰岛素分泌能力被miR-18敲除部分消除*P<0.05。miR,microRNA;IL、白细胞介素;NC,阴性对照。
图3。
图3。
miR-18促进胰岛β细胞凋亡。(A) TUNEL分析表明miR-18模拟物促进胰岛β细胞凋亡,而miR-18敲除则获得相反的结果(放大倍数×100)。Western blot分析表明,miR-18模拟物转染MIN6细胞(B)显著上调促凋亡基因Bax,(C)下调抗凋亡基因Bcl-2*P<0.05。miR,microRNA;末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记;Bcl-2,B细胞淋巴瘤2;Bax,Bcl-2相关X蛋白;NC,阴性对照。
图4。
图4。
miR-18抑制胰岛β细胞中NAV1的表达。(A) NAV1及其突变型NAV1序列3′-UTR中miR-18-5p的互补结合序列。(B) 由上述NAV1的WT和MUT片段驱动的荧光素酶报告质粒与miR-18模拟物或NC模拟物共同转染到MIN6细胞中。在存在miR-18模拟物的情况下,发现WT组的荧光素酶活性降低,但MUT组没有。(C) 与用miR-18抑制剂和MUT型NAV1共转染的细胞相比,用miR-18抑制剂和WT NAV1共转染的细胞表现出较低的萤光素酶活性。(D) miR-18负调控NAV1的mRNA和(E)蛋白水平*P<0.05。miR,microRNA;NAV1,神经元导航器1;UTR,非翻译区;WT,野生型;MUT,突变体;NC,阴性对照。
图5。
图5。
miR-18抑制胰岛β细胞中的PI3K/AKT通路。(A) miR-18模拟物导致MIN6细胞中p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的显著降低。(B) miR-18敲除导致MIN6细胞中的AKT/AKT和p-PI3K/PI3K水平显著上调*P<0.05。miR,microRNA;p-PI3K,磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶;NC,阴性对照。

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