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.2019年8月；20(2):1781-1789.
doi:10.3892/mmr.2019.10410。 Epub 2019年6月21日。

RNA干扰敲除GC结合因子2抑制血管平滑肌细胞的侵袭和迁移

英马 1, 任永强 2, Jun Guan先生 2
附属公司

RNA干扰敲除GC结合因子2抑制血管平滑肌细胞的侵袭和迁移

英马等。 分子医学代表. 2019年8月.

摘要

GC结合因子2（GCF2）是一种转录阻遏物，可抑制富含GC的启动子的转录，从而调节包括增殖在内的生物过程。然而，GCF2在血管平滑肌细胞（VSMC）中的作用尚不清楚。用免疫荧光法测定α‑平滑肌（α‑SM）肌动蛋白的水平。分别使用细胞计数试剂盒-8、伤口愈合和Transwell测定分析细胞活力、迁移和侵袭。采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期进展。通过逆转录定量（RT‑q）PCR和western blot分析测定Bcl‑2、Bax、裂解caspase‑3、cyclin E、CDK2和CDK抑制剂p21的表达。进行RT-qPCR以分析GCF2的水平，并进行蛋白质印迹分析以确定PI3K和AKT的磷酸化水平。发现α‑SM actin在VSMC中表达。靶向GCF2的小干扰RNA抑制了细胞存活、迁移和侵袭。Bcl-2、Bax和裂解的胱天蛋白酶-3表达水平的变化表明，siGCF2提高了细胞的促凋亡能力。siGCF2诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，并伴有细胞周期蛋白E、CDK2和p21水平的变化。此外，PI3K和AKT的磷酸化被siGCF2抑制。然而，胰岛素样生长因子1（AKT的特异性激动剂）增加了siGCF2对细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用。siGCF2的抗增殖活性可能与VSMC中的PI3K/AKT途径有关。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
siGCF2降低了存活率。（A） 免疫荧光法检测α-SM肌动蛋白。（B） 通过逆转录定量PCR检测siGCF2的转染效率。（C） 使用细胞计数试剂盒-8测定细胞活力*与各自对照组相比，P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^与各自的siNC相比，P<0.01。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA；α-SM，α-平滑肌肌动蛋白；外径，光密度。
图2。
图2。
siGCF2抑制了迁移和入侵。（A） 细胞迁移能力通过伤口愈合试验（放大倍率；×200）测定。（B） 使用Transwell分析法（放大倍数：×200）分析侵袭情况**与各自对照组相比P<0.01；^^与各自的siNC相比，P<0.01。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA。
图3。
图3。
siGCF2可增加细胞凋亡。（A） 流式细胞仪检测细胞凋亡水平。（B） 通过逆转录定量PCR测定Bcl-2和Bax的mRNA水平。（C） 通过蛋白质印迹分析测定Bcl-2、Bax和裂解的胱天蛋白酶-3的蛋白水平。（D） 使用GAPDH标准化对western blot分析进行量化**与各自对照组相比P<0.01；^^与各自的siNC相比P＜0.01。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA。
图4。
图4。
G细胞周期阻滞0/G公司1相位由siGCF2诱导。（A） 流式细胞术分析细胞周期进展。（B） 通过逆转录定量PCR测定细胞周期蛋白E、CDK2和p21的mRNA水平。（C） western blot分析测定细胞周期蛋白E、CDK2和p21的蛋白水平。（D） 使用GAPDH标准化对western blot分析进行量化*与各自对照组相比，P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^与各自的siNC相比，P<0.01。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA。
图5。
图5。
siGCF2降低了PI3K和AKT的磷酸化。（A） 通过western blot分析测定磷酸化PI3K和AKT水平。（B） 使用GAPDH标准化对western blot分析进行量化**与各自对照组相比P<0.01；^^与各自的siNC相比，P<0.01。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA；p-PI3K，磷酸化PI3K；p-AKT，磷酸化AKT。
图6。
图6。
IGF-1逆转了siGCF2引起的存活率、迁移率和侵袭率下降。（A） 使用细胞计数试剂盒-8测定活性。（B） 使用伤口愈合测定法测定细胞迁移的能力。（C） 使用Transwell迁移分析分析侵袭。（D） 迁移的代表性图像（放大倍率，×200）和（E）侵袭的代表性图片*与相应的对照组相比P＜0.05；^与各自的siNC相比P<0.05；#与各自的siGCF2相比P<0.05；&与各自的siNC+IGF-1相比，P<0.05。GCF2，GC结合因子2；siGCF2，靶向GCF2的小干扰RNA；siNC，非靶向小干扰RNA；胰岛素样生长因子1；外径，光密度。
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