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.2019年8月;20(2):1645-1654.
doi:10.3892/mmr.2019.10426。 Epub 2019年6月25日。

软骨软骨细胞中葡萄糖转运体9和尿酸转运体1的尿酸转运能力

附属公司

葡萄糖转运蛋白9和尿酸盐转运蛋白1在软骨细胞中的尿酸盐转运能力

张冰清(音)等。 摩尔医学代表. 2019年8月.

摘要

由可溶性尿酸(sUA)持续增加和沉积引起的慢性痛风性关节炎可导致病理性软骨细胞破坏;然而,尿酸盐转运和细胞内sUA对软骨细胞功能和活性的影响尚未完全确定。因此,本研究的目的是研究软骨细胞中尿酸盐转运系统的存在和功能。通过western blotting、逆转录定量PCR、免疫组织化学和免疫荧光检测了两种主要尿酸重吸收转运体葡萄糖转运体9(GLUT9)和尿酸转运体1(URAT1)在人类关节软骨和软骨细胞系中的表达谱。然后,将软骨细胞与浓度不断增加的外源性sUA一起孵育。阴性对照分析通过慢病毒短发夹(sh)RNA特异性敲除GLUT9和URAT1,以及通过苯溴马隆预处理进行,苯溴马龙是这两种转运体的已知抑制剂。采用比色法测量细胞内UA浓度。测定软骨组织和软骨细胞系中GLUT9和URAT1的表达水平。用sUA培养软骨细胞导致细胞内尿酸浓度的浓度依赖性增加,GLUT9或URAT1基因敲除或苯溴马隆预处理都会抑制这种增加(分别减少27.13±2.70、44.22±2.34和58.46±2.32%)。特别是,苯溴马隆进一步将HC‑shGLUT9和HC−shURAT1细胞中已降低的细胞内UA浓度分别降低了46.79±2.46和39.79±2.22%。过度表达GLUT9和URAT1的细胞被用作阳性细胞对照,这表明细胞内UA浓度增加,可以通过苯溴马隆治疗逆转。总之,软骨细胞可能具有活跃的UA转运系统。GLUT9和URAT1协同将UA转运到软骨细胞细胞质中,这一过程受到特定基因敲除和药物诱导抑制的抑制。这些结果可能是进一步研究sUA在痛风性关节炎期间诱导软骨细胞病理变化的基础,并确定UA转运过程是早期控制慢性痛风性膝关节炎的潜在靶点。

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图1。
图1。
人类软骨中尿酸转运体的蛋白表达。通过western blot分析测定,人类关节软骨样本(I至V)显示II型胶原、GLUT9和URAT1阳性表达。误差条表示western blot复制。GLUT9,葡萄糖转运蛋白9;URAT1,尿酸转运蛋白1。
图2。
图2。
人类软骨中尿酸转运体表达的组织学分析。通过免疫组化分析,人类关节软骨样本(I至V)显示II型胶原、GLUT9和URAT1阳性表达。使用尼康Microphot-FX显微镜拍摄数字图像[放大倍数×100(样品II)和×200(所有五个样品)]。显示了具有代表性的图像。GLUT9,葡萄糖转运蛋白9;URAT1,尿酸转运蛋白1。
图3。
图3。
GLUT9和URAT1在人软骨细胞中的表达。(A) 使用β-肌动蛋白作为内源性对照,对HC-A细胞中GLUT9和URAT mRNA表达进行逆转录定量PCR分析。(B) 使用FITC-偶联小鼠抗兔免疫球蛋白G抗体(绿色)和DAPI(蓝色)对HC-a、HC-shGLUT9和HC-shURAT1细胞进行免疫荧光。分别以β-肌动蛋白、Na-K ATP酶和GADPH为负荷对照,对(C)总蛋白、(D)膜蛋白和(E)细胞质蛋白含量进行Western blot分析。数据表示为平均值±标准偏差(n=3)*与HC-a.GLUT9、葡萄糖转运蛋白9相比,P<0.05;URAT1,尿酸转运蛋白1;sh,短发夹RNA;具有GLUT9敲低的HC-shGLUT9、HC-a细胞;HC-shURAT1、HC-a细胞与URAT1基因敲除;用干扰RNA转导HC-sc、HC-a细胞;苯溴马隆。
图4。
图4。
软骨细胞中GLUT9和URAT1的UA转运分析。(A) HC-A细胞与外源性sUA孵育后,细胞内UA浓度呈浓度依赖性增加(R2=0.9932)。(B) 用sUA(1 mM)与BEN(50µM)预处理或不预处理孵育后的细胞内UA浓度。数据表示为平均值±标准偏差(n=3)*与对照组相比P<0.05#在相同的培养条件下,与HC-a细胞相比,P<0.05;§与sUA相比,P<0.05。GLUT9,葡萄糖转运蛋白9;URAT1,尿酸转运蛋白1;sh,短发夹RNA;HC-shGLUT9、HC-a细胞GLUT9敲除;HC-shURAT1、HC-a细胞与URAT1基因敲除;用干扰RNA转导HC-sc、HC-a细胞;苯溴马隆;(s) 尿酸,(可溶性)尿酸。
图5。
图5。
293细胞的表达和UA转运分析。(A) Western blot分析显示转导293细胞中GLUT9和URAT1过度表达*与293相比,P<0.05。(B) 浓度依赖性增加293、GLUT9-293和URAT1-293细胞内UA浓度。(C) 用sUA(1 mM)与BEN(50µM)预处理或不预处理孵育后的细胞内UA浓度。空载体转导不影响蛋白质表达或转运功能。数据表示为平均值±标准偏差(n=3)*与对照组相比P<0.05#在相同的培养条件下,与HC-a细胞相比,P<0.05;§与sUA相比,P<0.05。GLUT9,葡萄糖转运蛋白9;URAT1,尿酸转运蛋白1;GLUT9-293、293细胞过度表达GLUT9;URAT1-292393细胞过表达URAT1;苯溴马隆;(s) 尿酸,(可溶性)尿酸。

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