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.2019年7月8日；36（1）:68-83.e9。
doi:10.1016/j.cell.2019.05.015。 Epub 2019年6月27日。

RAC1系统第29页通过血清反应因子诱导间充质表型转换促进黑色素瘤的发生和治疗抵抗

丹尼尔·A·狮子座 1, 大卫·C·汉考克 1, 萨雷娜·拉纳 2, 菲利普·伊斯特 三, 克里斯托弗·摩尔 1, 米盖尔·穆里略 2, 乔安娜·卡瓦略 4, 布拉德利·斯宾塞-迪内 4, 埃莉诺·赫伯特 5, 戈登邮票 4, 贾米尔·达米 6, 迪尼斯·P·卡拉多 6, 伊恩·罗斯韦尔 7, 拉尔夫·弗里奇 8, 理查德·诺伊比格 9, 米里亚姆·莫里纳·阿卡斯 10, 朱利安向下 11
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RAC1系统第29页通过血清反应因子诱导间充质表型转换促进黑色素瘤的发生和治疗抵抗

丹尼尔·A·狮子座等。 癌细胞. .

摘要

RAC1 P29是人类皮肤黑色素瘤中第三常见的突变密码子，仅次于BRAF V600和NRAS Q61。在这里，我们研究RAC1的作用第29页发现RAC1第29页激活PAK、AKT和由SRF/MRTF转录途径启动的基因表达程序，导致黑素细胞向间充质表型转换。RAC1普遍表达的小鼠第29页从内源性位点发展为淋巴瘤。仅在黑素细胞中表达时，RAC1第29页与致癌性BRAF或NF1缺失协同促进肿瘤发生。RAC1系统第29页也会导致对BRAF抑制剂的耐药性，而SRF/MRTF抑制剂可以逆转这种耐药性。这些发现确立了RAC1第29页作为黑色素瘤启动的促进剂和治疗耐药的介质，同时确定SRF/MRTF为潜在的治疗靶点。

关键词：BRAF；EMT；MRTF；NF1；PTEN；RAC1；SRF；黑色素瘤；p53基因。

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数字

无
图形摘要
图1
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RAC1激活的影响第29页黑素细胞存活研究（A）ER-RAC1示意图第29页融合蛋白系统。ER，雌激素受体；4OHT、4-羟基他莫昔芬；HSP、热休克蛋白。（B） MCF10A细胞（左）和稳定表达ER-RAC1的小鼠黑素细胞系melan-a（右）中RAC1-GTP的检测第29页用500 nM 4OHT和ER-RAC1处理细胞24 h第29页使用下拉分析评估与PAK1 RAC1结合域的结合。（C） 通过ER-RAC1实现PAK1/2和ERK1/2磷酸化第29页在黑素细胞中。用500 nM 4OHT处理细胞24 h；t检验与0h对比，采用Holm-Sidak校正进行多次检验；∗p<0.05，∗∗∗p<0.001；不另作统计分析，无统计学意义。（E） ER-RAC1引起的形态学变化第29页黑素激活——用500 nM 4OHT处理的黑素细胞。（F） 黑色素a黑素细胞与ER-RAC1的活性第29页在生长因子减少培养基中（胎牛血清[FCS]0.25%，12-O-十四烷酰基佛波-13-乙酸酯[TPA]不含）。用1μM 4OHT处理细胞，并用CellTiter-Glo对细胞活力进行量化（n=3个独立实验）；采用t检验进行统计比较。（G） 激活ER-RAC1的黑色素a细胞的软琼脂球形成第29页细胞在含有1μM 4OHT的全培养基中培养3周，然后进行染色、成像和自动计数（n=3个生物复制品）。（H） ER-RAC1激活的影响第29页黑色素a细胞的凋亡。用1μM 4OHT处理细胞。对裂解的caspase-3进行定量，并将其归一化为细胞活性（n=2个独立实验，每个实验三个生物重复）。条形代表平均值±SD。另请参见图S1。
图2
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急性激活RAC1的作用第29页AKT和SRF/MRTF效应器通路上的黑素细胞（A）使用ER-RAC1的逆相蛋白阵列第29页RAC激活后的黑素细胞，以散点图表示，与0小时对照组相比，其p值和对数变化为2倍（来自3个独立实验的平均值）。（B） 通过免疫印迹法测定磷酸化-AKT水平的密度定量，归一化为总AKT水平。三聚氰胺-a ER-RAC1第29页用500nM的4OHT处理细胞（n=4个独立实验，显示一个代表性免疫印迹）；采用t检验进行统计比较。（C） ER-RAC1中的RNA测序（RNA-seq）第29页黑素细胞，表示为空载体细胞和ER-RAC1的散点图第29页用500 nM 4OHT处理的细胞。蓝色圆点表示与0 h值在统计上不同的值（错误发现率[FDR]5%）。（D） ER-RAC1激活后4h黑素细胞基因表达变化的转录因子靶点富集分析第29页使用MSigDB数据库（Broad）中的转录因子靶基因集进行基因集富集分析（GSEA）。NES，标准化浓缩分数。（E） Esnault等人直接SRF靶基因集的GSEA图。（2014），使用ER-RAC1中表达的所有基因第29页4OHT处理4小时和0小时时的黑素细胞。（F） 规范SRF/MRTF靶的标准化RNA-seq读取计数（n=3个独立实验）。（G） ER-RAC1激活40小时后黑素细胞基因表达变化的路径富集分析第29页GSEA使用来自MSigDB的精选特征基因集集合。（H） 利用ER-RAC1基因表达差异绘制MSigDB上皮-间充质转化（EMT）标志基因集的GSEA图第29页与0小时对照组相比，4OHT处理黑素细胞40小时。（一） 激活ER-RAC1的黑素细胞中间充质标志物的相对mRNA第29页，使用RNA-seq定量（n=3个独立实验）。（J） SRF/MRTF抑制剂对ER-RAC1诱导骨髓间充质标志物的影响第29页在4OHT处理（1μM）前1 h用5-10μM CCG-1423或CCG-203971预处理细胞48 h（n=3个独立实验）；用qPCR测定mRNA水平，并将其归一化为Gapdh公司表达式。对于所有图表：条形图表示平均值±SD。另见图S2。
图3
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内源性RAC1的影响第29页黑素细胞AKT和SRF/MRTF激活与间充质表型（A）种族1LSL−P29S等位基因。（B）Rosa26-CreER公司+/–;种族1LSL−P29S/重量和Rosa26-CreER公司+/–;种族1重量/重量使用1μM 4OHT分离和重组MEF。使用下拉分析评估RAC1的激活。（C） MEF中PAK1/2和AKT在重组后的磷酸化种族1LSL−P29S4OHT处理的等位基因（1μM）。（D） 小鼠黑素细胞中PAK1/2和AKT与内源性RAC1的磷酸化第29页显示了每个基因型三种独立培养物的免疫印迹。（E） 内源性RAC1对黑素细胞基因表达变化的转录因子靶点富集分析第29页与RAC1相比重量GSEA是使用MSigDB中的转录因子靶基因集集合与来自种族1LSL−P29S/重量小鼠与种族1重量/重量小鼠（每个基因型3个独立培养物）。（F） GSEA结果使用Esnault等人的SRF/MRTF/TCF基因集。（2014），应用于用内源性RAC1培养的黑色素细胞的RNA-seq数据第29页与RAC1相比重量显示了MRTF直接目标的GSEA图。（G） 内源性RAC1黑素细胞典型SRF/MRTF靶点的正常mRNA读取计数第29页（n=每个基因型3个独立培养物）；Wald检验与Benjamini-Hochberg校正相结合。（H） 使用来自MSigDB的黑素细胞RNA-seq数据绘制的EMT标记基因集GSEA图种族1LSL−P29S/重量小鼠与种族1重量/重量小鼠（每个基因型3个独立培养物）。（一） 抑制SRF/MRTF通路对内源性RAC1小鼠黑素细胞波形蛋白mRNA表达的影响第29页用10–25μM CCG-1423或CCG-203971处理细胞，并饥饿TPA 24 h（n=3个独立实验）。对于所有图表：条形图表示平均值±SD。另请参见图S3。
图4
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内源性RAC1细胞AKT和MRTF依赖性的发现第29页（A） Rac1的黑素细胞培养重量/重量和Rac1LSL−P29S/重量小鼠在生长因子减少培养基（FCS 0.25%，无TPA）中生长，并使用CellTiter-Glo检测其生存能力；所示基因型的p值采用双向方差分析。（B） 黑素细胞的单细胞悬浮液种族1重量/重量和种族1LSL−P29S/重量在成像和自动计数之前，将小鼠（每个基因型3个独立培养物）接种在软琼脂中3周。（C） 黑素细胞来自种族1重量/重量和种族1LSL−P29S/重量用定制的siRNA文库（n=205个池）转染小鼠，在不含TPA的培养基中生长3天，并测定活力（每个基因型n=3个独立培养物，每个培养物在三个独立实验中测定）。（D） RAC1效应siRNA筛选数据的详细图如（C）所示。对照siRNA（顶部）和用内源性RAC1特异性杀死黑色素细胞的siRNA第29页（底部）。（E） SRF/MRTF、PAK和AKT通路抑制剂联合治疗对RAC1黑素细胞活性的影响重量（左）或内源性RAC1第29页（右）。小鼠黑素细胞培养物在常规培养基中培养，并在开始药物治疗72小时后测定其活性。抑制剂剂量：CCG-203971（SRF/MRTF）10μM、G-5555（PAK）和MK-2206（AKT）2μM。（F） RAC1或BRAF表达减少对人类黑色素瘤细胞系生存能力的影响。细胞在生长培养基中培养，并在转染后96 h检测存活率（BRAF组每种基因型5个细胞株，RAC1组每种遗传型7个细胞系，点表示在多个独立实验中测试的单个细胞系的平均值）；t检验的p值。（G） 靶向RAC1效应器的药物面板在含RAC1的人黑色素瘤细胞系中的应用第29页与RAC1细胞系相比重量细胞在生长培养基中培养，并在开始药物治疗72小时后测定其活力。根据RAC1的半最大抑制浓度（μM）之间的百分比差异对药物进行排名重量细胞系和RAC1第29页细胞系。对于每种药物，使用双向方差分析来探测基因型效应的完整数据集，根据Benjamini-Hochberg进行校正以产生FDR q值；未确定N.D.，因为曲线拟合失败。（H） 使用CellTiter-Glo测定用SRF/MRTF抑制剂CCG-1423处理的人黑色素瘤细胞系的存活率（n=7个细胞系/基因型，每个细胞系使用两个独立实验的平均值）；按（F）所述进行统计分析。（一） 内源性RAC1诱导小鼠黑素细胞凋亡第29页或RAC1重量在生长培养基中培养，并用250 nM、500 nM或1μM的奥巴托拉索处理3天（n=2-3个独立培养物/基因型）。（J） SRF/MRTF信号通路示意图。对于所有图表：条形图表示平均值±SD。另请参见图S4。
图5
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RAC1普遍表达的影响第29页在体内关于B细胞淋巴瘤的诱导（A）PGK-Cre/Rac1系列LSL−P29S胚胎时间分析结果的交叉和总结。PGK-Cre公司一直是母性的，以确保所有胚胎中的生殖系Cre重组。指出了由chi-square检验得出的p值。（B） 显示严重心血管异常和发育迟缓的典型显微照片种族1LSL−P29S/重量胚胎（E10.5）。红色箭头，心包腔扩大。（C） 表达RAC1的实验设计示意图第29页在成年小鼠的全身。三苯氧胺经口灌胃给药。（D） 具有指定基因型的老年小鼠脾脏的代表性图像和脾脏重量的量化。横线代表平均值±SD（n=8-13只小鼠/基因型）；用于统计比较的Mann-Whitney检验。（E） 三苯氧胺治疗后指示基因型小鼠的无瘤生存曲线。显示了对数秩测试（Mantel-Cox）的结果。（F） 消化道的代表性照片Rosa26-CreER公司+/–;种族1重量/重量小鼠与肠系膜淋巴瘤Rosa26-CreER公司+/–;种族1LSL−P29S/重量鼠标。红色箭头，淋巴瘤。（G） 对照小鼠肠系膜淋巴瘤和正常肠系膜淋巴结的代表性H&E和B220染色切片。（H） 正常脾脏的代表性H&E和B220染色切片Rosa26-CreER公司+/–;种族1重量/重量小鼠和脾脏、胸腺淋巴瘤和皮肤鳞状细胞瘤Rosa26 CreER公司+/——;种族1LSL−P29S/重量老鼠。另请参见图S5。
图6
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RAC1黑素细胞表达的影响第29页在体内肿瘤发生学（A）轮胎-冷却器,布拉夫加利福尼亚州和种族1LSL−P29S等位基因组合。（B） 无黑色素瘤生存曲线轮胎-冷却器+/–;布拉夫CA/WT公司;种族1重量/重量小鼠和轮胎-冷却器+/–;布拉夫CA/WT公司;种族1LSL−P29S/重量采用对数秩检验（Mantel-Cox）对小鼠进行比较。（C） RAC1的影响第29页关于肿瘤数轮胎-冷却器+/–;布拉夫钙/重量老鼠。各组采用Mann-Whitney试验进行比较（每个基因型12–13只小鼠）。（D） 的示意图轮胎-冷却器,铂族F类,布拉夫加利福尼亚州、和种族1LSL-P29S型等位基因组合。（E） 总生存曲线轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司;种族1重量/重量小鼠和轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司;种族1LSL−P29S/重量使用对数秩检验（Mantel-Cox）对小鼠进行比较。（F） RAC1的影响第29页关于肿瘤数轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司老鼠。各组采用Mann-Whitney试验进行比较（每个基因型5-9只小鼠）。（G） 的示意图轮胎-冷却器,Trp53基因F类,布拉夫加利福尼亚州、和Rac1型LSL−第29页等位基因组合。（H） 无黑色素瘤生存曲线轮胎-冷却器+/–;Trp53基因前/后;布拉夫CA/WT公司;种族1重量/重量小鼠和轮胎-冷却器+/–;Trp53基因前/后;布拉夫CA/WT公司;种族1LSL−P29S/重量采用对数秩检验（Mantel-Cox）对小鼠进行比较。（一） RAC1的影响第29页关于肿瘤数轮胎-冷却器+/–;Trp53基因前/后;布拉夫CA/WT公司老鼠。各组采用非配对双尾t检验进行比较（每个基因型7–9只小鼠）。（J） 各种小鼠黑色素瘤模型背部皮肤的代表性照片和组织学。所有老鼠都是轮胎-冷却器+/–，并显示其他等位基因。显示自4OHT治疗以来的时间。对于所有图表：条形图表示平均值±SD。另见图S6。
图7
图7
RAC1的影响第29页利用来自MSigDB的EMT标志基因集的BRAF-Driven黑色素瘤（A）GSEA图中肿瘤裂解物的RNA-seq数据，研究BRAF-Deriven黑素瘤的耐药性和间充质表型轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司;种族1LSL−P29S/重量小鼠与肿瘤裂解物轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司;种族1重量/重量小鼠（每组5至6只动物，n=6个肿瘤）。（B） 肿瘤裂解物中间充质标记物的正常mRNA读取计数轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司老鼠。为了对各组进行统计比较，采用了Wald检验和Benjamini-Hochberg校正（每个基因型5到6只动物中有6只肿瘤）。（C） RAC1表达的影响第29页黑色素瘤的肿瘤结构。代表性肿瘤切片用H&E或黑色素瘤细胞标记物S100和SOX10染色（免疫组织化学）。（D） 肿瘤是在Tyr CreER公司+/——;铂族F/重量;布拉夫CA/WT公司小鼠局部4OHT。在肿瘤形成后，用加入到猪体内的PLX4720治疗动物。使用双向方差分析比较肿瘤生长曲线，并显示基因型效应的p值（每个数据点6至10只动物的n=18–44个肿瘤）。包括肿瘤的代表性照片。（E） 在（D）中所示的实验结束时，采集肿瘤，进行裂解，并用所示抗体进行免疫印迹。（F） 的影响RAC1系统第29页S/L黑色素瘤患者无复发生存期的突变状态。来自TCGA皮肤黑色素瘤队列的数据（n=309名患者，45%BRAF公司多用途终端和55%BRAF公司重量)使用了。使用对数秩检验（Mantel-Cox）对各组进行比较，并显示p值。（G） 在通过局部4OHT建立肿瘤后，动物被口服PLX4720和CCG-257081。使用双向方差分析比较肿瘤生长曲线，并显示基因型效应的p值（每个数据点3到4只动物的n=10-15个肿瘤）。（H） GSEA使用Tsoi等人开发的四种黑色素瘤分化状态特征进行。（2018），结合ER-RAC1变化的RNA-seq数据集第29页黑素细胞处理的4OHT（n=3个独立实验；左侧面板），来自含有内源性RAC1的黑素细胞的RNA-seq数据第29页与RAC1相比重量（n=每个基因型3个独立培养物；中间面板）和来自轮胎-冷却器+/–;铂族F/WT（飞行/重量）;布拉夫CA/WT公司;种族1LSL−P29S/重量小鼠与轮胎-冷却器+/——;铂族F/重量;布拉夫CA/WT公司;种族1重量/重量小鼠（n=6个肿瘤，每组5-6只；右侧）；显示了p值。对于所有图表：显示平均值±SD。另请参见图S7。
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