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.2019年8月；38(31):5971-5986.
doi:10.1038/s41388-019-0853-z。 Epub 2019年6月28日。

TBX2与异染色质蛋白1相互作用，向EGR1靶向启动子招募新的抑制复合物，以驱动乳腺癌细胞的增殖

N T克劳福德 # 1, A J麦金太尔 # 1, 麦考密克 1, Z C D’Costa公司 1, N E巴克利 1, P B穆兰 2
附属公司

TBX2与异染色质蛋白1相互作用，向EGR1靶向启动子招募新的抑制复合物，以驱动乳腺癌细胞的增殖

N T克劳福德等。 癌基因. 2019年8月.

摘要

早期生长反应1（Early Growth Response 1，EGR1）是一种在乳腺组织中具有多种肿瘤抑制作用的应激反应转录因子，其在乳腺癌中的表达经常缺失。我们之前已经证明乳腺癌癌基因TBX2（T-BOX2）与EGR1相互作用，共同抑制EGR1靶基因，包括乳腺癌抑制因子NDRG1。在这里，我们展示了TBX2阻遏复合物的机制基础。我们发现，siRNA敲低TBX2、EGR1、异染色质蛋白1（HP1）亚型和通用HP1相关辅压蛋白KAP1都导致表达TBX2的乳腺癌细胞的生长抑制。我们发现TBX2通过其N末端的保守HP1结合基序与HP1相互作用，这反过来导致KAP1和其他相关蛋白的招募。TBX2 HP1结合域的突变消除了TBX2-HP1相互作用和靶基因（如NDRG1）抑制的丧失。染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，TBX2在NDRG1近端启动子周围建立了一个抑制性染色质标记，特别是H3K9me3，与DNA甲基转移酶DNMT3B和组蛋白甲基转移酶（HMT）复合物组分（G9A、Zeste 2增强子（EZH2）和Zeste 12抑制子（SUZ12）的招募一致). G9A、EZH2或SUZ12的敲除导致TBX2/EGR1共同调节靶点的上调，同时伴有细胞增殖的显著抑制。我们发现HMT活性的通用抑制剂DzNep复制了诱导型显性阴性TBX2的表达。敲除TBX2、KAP1或HP1可通过H3K9me3阻遏标记特异性地抑制NDRG1启动子的修饰。相应地，用G9A抑制剂治疗可有效逆转TBX2对NDRG1的阻遏，并在TBX2功能抑制后协同下调细胞增殖。这些数据表明，TBX2通过向EGR1应答启动子招募大的抑制复合物来促进正常生长控制机制的抑制，从而导致乳腺癌细胞的不可控增殖。

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数字

图1
图1。敲除KAP1/HP1蛋白抑制MCF7细胞的增殖。
一代表MCF7细胞生长的条形图，用一组抗（i）联合阻遏蛋白或（ii）组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的siRNA筛选。细胞在MTT测定之前生长5天。每一次转染均进行了三次，并使用TBX2 siRNA作为阳性对照，计算细胞增殖与打乱对照（Scr）siRNA（cell growth%Scr）的关系。KAP1的击倒用一个倒箭头突出显示。误差线表示平均值±标准差。b条用抗（i）TBX2、（ii）EGR1或（iii）KAP1的siRNA和加扰（SCR）对照siRNA处理MCF7细胞7天。顶部面板显示了各自靶蛋白敲除的western blot验证，GAPDH用作负荷对照。通过结晶紫染色评估siRNA处理对细胞生长和SCR控制的影响，其定量显示在直方图下方。c（c）用抗（i）HP1-α、（ii）HP1-β或（iii）HP1-γ的siRNA和加扰（SCR）对照siRNA处理MCF7细胞7天。顶部面板显示了各自靶蛋白敲除的western blot验证，GAPDH用作负荷对照。与之前一样，通过结晶紫染色评估siRNA处理对细胞生长和SCR控制的影响。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns=与对照组相比不显著
图2
图2。TBX2与KAP1和HP1蛋白相互作用，抑制肿瘤抑制基因。
一（i） Western blot显示，在外源性表达GFP标记的HP1构建物以及FLAG标记的TBX2后，MCF7细胞裂解，并用抗GFP抗体进行下拉。顶部面板显示带有GFP的西方免疫印迹（IB），底部面板显示带有抗FLAG抗体。（ii）外源性表达FLAG标记的TBX2，然后用抗FLAG抗体和IB免疫沉淀内源性KAP1、HP1-α或HP1-γ，MCF7细胞裂解物的蛋白质印迹。（iii）使用BT474细胞裂解物免疫沉淀与HP1-γ或同种匹配IgG抗体的内源性co-IP，用HP1-γ抗体探测所得的western blot，以证明下拉效力和内源性KAP1（阳性对照）和TBX2特异性抗体。输入表示30μg总蛋白质。b条（i） 用靶向EGR1、KAP1或HP1-γ的siRNA转染MCF7细胞后，显示NDRG1启动子结构（−80/+4）的荧光素酶报告活性的条形图。每一次转染均进行了三次，并使用Renilla荧光素酶构建物作为转染对照，每一次治疗还显示了一个空载体（pGL3 basic）。误差条代表平均值±标准偏差（ii）MCF7细胞中NDRG1启动子内源性TBX2、EGR1、KAP1和HP1蛋白的ChIP分析。输入代表ChIP前5%的裂解物，一个同型匹配的IgG作为阴性对照ChIP。c（c）RqPCR值的柱状图显示了T47D细胞在120小时（i）和BT474细胞在96小时（ii）的KAP1的siRNA敲除与打乱（SCR）对照相比对TBX2和EGR1靶基因的表达产生的影响。SDHA mRNA用于正常值。误差条代表三个独立实验的平均值±s.e.m*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01
图3
图3。TBX2与HP1特异性相互作用，招募KAP1并抑制NDRG1启动子。
一（i） MCF7细胞的Western blot在空载体（EV）、FLAG标记的野生型TBX2（FL-TBX2）、一个FLAG-标记的单HP1位点突变体TBX2、或一个FLAG-标记的双HP1位点突变TBX2的外源表达后裂解。TBX2上进行SDM的两个HP1结合基序的位置详见下图（关键残基以红色突出显示），TBX2 DM包含两个所述突变。使用抗FLAG抗体进行下拉，并对所得印迹进行内源性HP1-γ免疫印迹。（ii）在外源性表达空载体（EV）、FLAG标记的野生型TBX2（FL-TBX2）或FLAG-标记的单HP1位点突变TBX2后，MCF7细胞裂解产物的蛋白质印迹（Western blot）。使用抗FLAG抗体进行下拉，并对所得印迹进行内源性KAP1免疫印迹。以下密度测定值显示了归一化为FLAG标记TBX2的共同免疫沉淀蛋白的数量。b条（i） 条形图显示了在MCF7细胞中转染以下结构后NDRG1启动子结构（−80/+4）的荧光素酶报告活性一每一次转染均进行了三次，并使用Renilla荧光素酶构建物作为转染对照，每个治疗也显示了一个空载体（pGL3 basic）。（ii）显示空载体（EV）、FLAG标记野生型TBX2（TBX2）或FLAG标记的单HP1位点突变型TBX2（TBX2/HP1突变型）转染后，MCF7细胞中NDRG1启动子构建物（−80/+4）的荧光素酶报告活性的条形图。在测量荧光素酶活性之前，使细胞未经处理或用1μM阿霉素（+Dox）处理24小时。每一次转染均进行了三次，并使用Renilla荧光素酶构建物作为转染对照，每一次治疗还显示了一个空载体（pGL3 basic）。误差线表示平均值±标准误差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）0.001; ns=不显著。c（c）免疫荧光显微镜图像显示，MCF7细胞转染了FLAG标记的野生型TBX2（FL-TBX2）或FLAG标记单HP1位点突变型TBX2（FL-TBX2 mut1）。FITC-结合二级抗体（绿色）显示转染细胞，两种结构均定位于细胞核，而DAPI反染用于显示细胞核。d日Western blot显示MCF7细胞在外源性表达空载体（EV）、单（顶面板，mut1）或双（底面板，DM）HP1位点突变、FLAG标记的TBX2后裂解。用抗FLAG抗体（以及作为阴性对照的同型匹配IgG）进行下拉，并用抗EGR1抗体探测所得印迹。电子（i） MCF7细胞裂解产物的Western blot显示空载体（EV）、FLAG标记野生型TBX2（FLTBX2）或FLAG标记的单HP1位点突变体TBX2的外源表达（FLTBX2 mut1）。GAPDH用作加载控制。（ii）使用抗FLAG和抗KAP1抗体以及同型匹配IgG抗体对−80/+4 NDRG1近端启动子（如（i）所述转染的细胞）进行ChIP分析。输入表示下拉前5%的裂解物，水作为阴性对照（控制车道）
图4
图4。TBX2招募阻遏物和阴性染色质标记来靶向启动子。
一（i） 使用跨越−80/+4 NDRG1近端启动子的ChIP引物转染空载体（EV）和FLAG标记的野生型TBX2（FLTBX2）构建物后，对MCF7细胞进行ChIP分析。使用抗FLAG、抗SETDB1和抗H3K9me3抗体进行下拉，并将同型匹配IgG抗体作为阴性对照。输入代表下拉前5%的裂解物。（ii）如（i）所述转染U2OS细胞并进行下拉，使用PRC2成分SUZ12和染色质标记H3K9me3和K27me3的特异性抗体进行免疫印迹，FLAG显示外源性FL-TBX2表达。b条Western blot显示了用TBX2或同种匹配IgG抗体免疫沉淀的MCF7细胞裂解物进行内源性co-IP实验，所得的blot用TBX2抗体进行探测，以证明下拉效力和针对所提议的抑制复合物（SUZ12、EZH2和DNMT3B）几个成员的抗体。裂解物（总蛋白30μg）显示每个蛋白的内源性表达。c（c）（i） RqPCR值条形图显示了96小时MCF7细胞中EZH2、SUZ12和G9A的siRNA敲除与打乱（Scr）对照的效果。SDHA mRNA用于正常值。（ii）与（i）中概述的样本匹配的TBX2/EGR1靶基因的mRNA柱状图，标准化为SDHA mRNA。误差条代表三个独立实验的平均值±s.e.m。（iii）与之前概述的siRNA转染96小时时的RqPCR实验相匹配的细胞计数。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。（iv）用之前描述的siRNA和干扰控制（SCR）siRNA处理11天后对结晶紫染色的MCF7细胞进行代表性扫描。（v）通过EZH2/SUZ12/G9A敲除后结晶紫染色定量评估相对存活率。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。d日（i） RqPCR值条形图显示了T47D细胞中EZH2、SUZ12和G9A在120小时时siRNA敲除与打乱（Scr）对照的效率。SDHA mRNA用于正常值。（ii）与（i）中概述的样本匹配的TBX2/EGR靶基因的mRNA条形图，归一化为SDHA mRNA。误差条形代表三个独立实验的平均值±标准偏差。（iii）与之前概述的siRNA转染120小时时的RqPCR实验相匹配的细胞计数。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。（iv）用之前描述的siRNA和干扰对照（SCR）siRNA处理19天后对结晶紫染色的T47D细胞进行代表性扫描。（v）通过EZH2/SUZ12/G9A敲除后结晶紫染色定量评估相对存活率。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）与所有图表的对照组相比<0.001
图5
图5。抑制TBX2可消除HMT和DNMT向靶向启动子的募集，并损害乳腺癌细胞的增殖。
一使用跨越−80/+4 NDRG1近端启动子的ChIP引物，四环素诱导显性阴性TBX2（-TET）细胞与未诱导（+TET）细胞后，对MCF7-DN细胞进行ChIP分析。使用（i）抗FLAG、抗KAP1、抗HP1γ和（ii）抗EZH2、抗SUZ12、抗H3K9me3和DNMT3B抗体进行下拉。使用针对NDRG1启动子上游约1 kb的非特异性基因组区域设计的引物进行阴性对照。输入代表下拉前5%的裂解物。b条从ChIP分析中获得的ChIP DNA的RqPCR测量条形图，如一，评估DN-TBX2对NDRG1启动子（FLAG）的富集以及对EZH2、SUZ12、G9A和DNMT3B招募的影响（−TET vs.+TET）。实验重复进行，误差条代表平均值±标准误差。c（c）在存在或不存在HMT通用抑制剂DzNep的情况下，对DN-TBX2诱导3天和6天的蛋白质印迹评估对NDRG1表达的影响。d日根据之前概述的西方实验对DN-TBX2和NDRG1蛋白表达进行密度定量c（c），正常化为3天+TET对照。误差线表示两个独立实验的平均值±标准差。电子显示六天期间MCF-DN生长曲线的图表，无（+Tet）或（−Tet）DN-TBX2诱导，有/无1μM DzNep联合治疗。实验一式三份，误差条代表平均值±标准差*P（P）<0.05**P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ns=不显著
图6
图6。TBX2/KAP1/HP1-γ复合物特异性介导NDRG1启动子的H3K9三甲基化，以维持乳腺癌细胞的生长和生存。
一使用跨越−80/+4 NDRG1近端启动子的ChIP引物对TBX2 siRNA处理72小时后的MCF7细胞进行ChIP分析。使用抗H3K9me3抗体与抗H3K27me3抗体进行下拉比较。b条用抗TBX2、KAP1和HP1-γ的siRNA处理MCF7细胞72小时。通过western blot分析在蛋白质水平上评估敲除效果，并以文丘林作为负荷对照。c（c）样本中TBX2 mRNA水平与b条通过RqPCR测定。SDHA mRNA用于正常值。误差线表示三个独立实验的平均值±标准误差。d日ChIP分析与中描述的击倒实验相匹配b条使用跨越NDRG1近端启动子的引物。TBX2/KAP1/HP1-γ敲除对NDRG1启动子甲基化的影响通过抗H3K9me3抗体下拉评估，而抗H3K27me3抗体作为阴性对照。电子用TBX2 siRNA处理MCF7细胞，如一对裂解产物进行Western blot，以评估组蛋白甲基转移酶（G9A，EZH2）、肿瘤抑制因子（NDRG1）和抗衰老蛋白（c-Myc，PARP，CDK1，KAP1）蛋白水平的下游影响。GAPDH抗体用作负荷控制。相邻条形图表示三个独立实验的密度计读数的平均值±标准偏差，这三个实验归一化为载荷控制。（f）用G9A抑制剂BIX-01294处理MCF7细胞72小时。对裂解产物进行Western blot，以评估TBX2、肿瘤抑制因子和抗衰老蛋白水平的下游影响，如前所述。将0 h与72 h进行比较的相邻条形图表示三个独立实验的密度计读数的平均值±s.d.，这些实验标准化为负载控制。克与MCF7实验相匹配的样本中mRNA水平的RqPCR测量电子和（f）分别是。SDHA mRNA用于正常值。误差线表示三个独立实验的平均值±标准误差。小时用二甲基亚砜或G9A抑制剂BIX-01294处理T47D细胞72小时。如前所述，进行Western blot以评估TBX2、肿瘤抑制因子和抗衰老蛋白水平的下游影响。相邻条形图表示三个独立实验的密度计读数的平均值±标准偏差，这三个实验归一化为载荷控制。对SDHA mRNA水平用于正常值的匹配mRNA进行RqPCR。误差线表示三个独立实验的平均值±标准误差。我在用二甲基亚砜或G9A抑制剂BIX-01294再治疗3天之前，诱导MCF7-DN细胞表达DN-TBX2（−Tet）或保持未诱导状态（+Tet）2天。图表显示了相对于未引入的DMSO对照物对细胞数量的影响。与DMSO处理的细胞相比，+Tet和−Tet组的G9A抑制细胞数量发生了折叠变化。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ns=对所有图表都不重要
图7
图7。NDRG1的拟议TBX2依赖抑制示意图
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