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.2019年6月28日;10(1):2876.
doi:10.1038/s41467-019-10753-5。

microRNAs miR-204和miR-211维持关节内环境稳定并防止骨关节炎进展

附属公司

microRNAs miR-204和miR-211维持关节内环境稳定并防止骨关节炎进展

黄健等。 国家公社. .

摘要

骨关节炎(OA)是一种常见的疼痛性疾病。目前OA是无法治愈的,其病因基本上未知,部分原因是对OA作为一种全关节疾病的认识有限。在这里,我们报告了两个同源的microRNA,miR-204和miR-211,维持关节内稳态以抑制OA发病。间充质祖细胞(MPC)中miR-204/-211的特异性敲除导致Runx2在多型关节细胞中积聚,导致全关节退行性变。具体而言,miR-204/-211功能丧失在关节软骨细胞和滑膜细胞中诱导基质降解蛋白酶,刺激关节软骨破坏。此外,miR-204/-211消融以Runx2依赖的方式增强NGF的表达,从而过度激活Akt信号和MPC增殖,这是包括滑膜增生、骨赘生长和软骨下硬化在内的多重非软骨性OA的潜在条件。重要的是,miR-204/-211-缺乏引起的OA主要是通过Runx2不足来挽救的,这证实了miR-204/-211-Runx2轴。此外,关节内注射miR-204表达的腺相关病毒可显著减缓OA进展。总之,miR-204/-211对于维持间充质关节细胞的健康稳态以对抗OA发病机制至关重要。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
种系删除miR-204型/-211导致多方面的OA表型。的示意图miR-204型(或miR-211型)条件敲除(cKO)等位基因。请注意,内容(如线、框和箭头)是不成比例的。b条46岁儿童的典型μCT图像miR-204型/-211floxed(对照)和global双基因敲除小鼠(miR-204型−/−;miR-211型−/−). 红色箭头,骨赘。n个 = 5.比例尺,1毫米。c(c)46岁儿童膝关节的典型组织学图像miR-204型/-211floxed小鼠和全局双KO(miR-204基因−/−;miR-211基因−/−)阿尔西安蓝/橙色G.黄色箭头染色小鼠,关节软骨丢失;红色箭头,骨赘;绿色箭头,滑膜增生;黑色箭头,软骨下硬化。n个 = 5.比例尺,200微米。,(f)内侧AC区的组织形态计量学定量()和钙化半月板区((f))46周大miR-204型/-211漂浮小鼠(对照)和miR-204型−/−;miR-211型−/−小鼠(突变型)****P(P) < 0.0001,n个 = 4或5。未付费学生的t吨测试。e(电子)使用国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分系统评估46周龄对照和突变小鼠的膝关节关节软骨(AC)破坏**P(P) < 0.01,Mann−Whitney试验。n个 = 6
图2
图2
的不足miR-204型/-211在间充质祖细胞中重述了OA的发病机制。42岁儿童的典型μCT图像miR-204型/-211floxed(control)和conditional double KO(dKO,带Prx1-芯)老鼠。红色箭头,骨赘。n个 = 5.比例尺,1毫米。b条42周(上)或33周(下)对照和dKO小鼠膝关节的代表性组织学图像,用阿尔西安蓝/橙色G染色。黄色箭头,关节软骨缺失;红色箭头,骨软骨植物;绿色箭头,滑膜增生;黑色箭头,软骨下硬化。n个 = 5.比例尺,200微米。c(c)33周龄对照组和dKO小鼠的von Frey试验结果。n个 = 6. **P(P) < 0.01,未成对学生t吨测试。,e(电子)使用高度特异性LNA增强的原位杂交miR-204型()或miR-211型(e(电子))7月龄小鼠膝关节切片上的探针(绿色)。底部面板是上图的放大图,如图所示。DAPI染色标记细胞核(蓝色)。红色箭头,miR-204型-miR公司-211-阳性细胞。比例尺,100微米。(f),qRT-PCR分析miR-204型miR-211型CD45中的表达来自对照组或dKO小鼠的BMSC**P(P)<0.01, ****P(P) < 0.0001,未成对学生t吨测试。n个 = 3.数据显示为平均值±标准差。
图3
图3
的不足miR-204型/-211上调Runx2、软骨代谢酶和成骨标志物。IHC结果显示,Runx2在dKO小鼠滑膜、关节软骨(AC)和膝关节半月板中的表达增强。红色箭头,Runx2-阳性细胞。比例尺,50微米。b条Western blot分析显示Runx2在CD45中积聚从dKO小鼠中分离的BMSC。印迹下方的数字表示与对照组相比,每组中Runx2(标准化为β-肌动蛋白)的相对蛋白质水平。n个 = 三。c(c)MMP13和Adamts5在对照和dKO小鼠中的IHC结果。箭头,IHC-阳性细胞。比例尺,100微米。qRT-PCR分析百万像素13,亚当斯5,神经生长因子(NGF公司)、和运行2对照组或dKO小鼠关节软骨细胞的表达。未付费学生的t吨测试。n个 = 3.数据显示为平均值±标准差。e(电子)碱性磷酸酶(ALP)染色(e(电子))、茜素红染色((f))和von Kossa染色()从对照或dKO小鼠分离的BMSCs。n个 = 三。小时qRT-PCR分析运行2,成骨相关转录因子抗体(奥斯克斯),阿尔卑斯山骨钙素(OC公司)CD45中的表达来自对照组或dKO小鼠的BMSC。未付费学生的t吨测试。n个 = 3.数据显示为平均值±标准差*P(P) < 0.05, **P(P)<0.01, ***P(P) < 0.001, ****P(P) < 0.0001.未截取的western blot扫描如补充数据1所示
图4
图4
骨髓间充质干/祖细胞的增殖在miR-204型/-211dKO小鼠。,b条代表性流式细胞术分析()和量化(b条)CD29的+/CD105型+/Sca-1型+CD45中的细胞从对照和dKO小鼠新鲜分离的滑膜细胞。n个 = 三。c(c)对照组和dKO小鼠增殖细胞核抗原(PCNA)的IHC结果。红色箭头,PCNA阳性细胞。比例尺(左侧面板),250μm。比例尺(右侧面板),100微米。,e(电子)代表性流式细胞术分析()和量化(e(电子))BrdU标记的CD45在体内标记并新鲜分离的细胞。n个 = 三。(f)定量RT-PCR分析第16页,第21页,第27页第57页CD45中的表达来自对照组或dKO小鼠的BMSC。n个 = 3.未付款学生的t吨测试。数据显示为平均值±标准差*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001
图5
图5
这个miR-204型/-211-Runx2轴调节NGF-Akt信号传导和间充质祖细胞增殖。Western blot分析显示dKO CD45中激活的Akt信号-BMSC。印迹下方的数字表明,与对照组相比,各组中所示蛋白质的相对水平(除p-Akt归一化为总Akt外,所有蛋白质归一化成β-actin)。n个 = 三。b条对照组和dKO小鼠p-Akt的IHC结果。蓝色箭头标记p-Akt-阳性细胞。比例尺,250μm(左)或50μm(右)。c(c)qRT-PCR分析Ngf公司CD45中mRNA的表达来自对照或dKO小鼠的BMSC**P(P)<0.01,未配对学生t吨测试。n个 = 三。对照组和dKO小鼠NGF的IHC结果。红色箭头,NGF阳性细胞。比例尺,50微米。e(电子)qRT-PCR分析Ngf公司mRNA显示miR-204型运行2siRNA减少Ngf公司CD45中的表达BMSC***P(P)<0.001,单向方差分析,然后进行Tukey−Kramer检验。n个 = 三。(f)CD45中两种NGF亚型的逆转录病毒过度表达western blot显示,WT小鼠的BMSCs激活Akt信号。n个 = 三。NGF过度表达增加CD45的增殖由细胞数计数确定的BMSC***P(P)<0.001,单因素方差分析。n个 = 三。小时qRT-PCR分析依赖激酶抑制蛋白小鼠CD45GFP或NGF过度表达的BMSCs**P(P)<0.01, ***P(P) < 0.001,未成对学生t吨测试。n个 = 三。Western blot分析表明Ngf公司敲除下调小鼠CD45中的Akt信号BMSC。n个 = 3.所有数据均显示为平均值±补充数据1显示了未截取的western blot扫描
图6
图6
关节内注射AAV5-miR-204可缓解手术诱导的OA表型。9个月龄C57BL/6小鼠在3个月龄时接受AAV5-GFP或AAV5-miR-204注射的骨关节炎关节的典型μCT图像。红色箭头,骨赘。n个 = 5.比例尺,1毫米。b条在3个月大时接受AAV注射的9个月大小鼠的骨关节炎关节的代表性组织学图像。黄色箭头,关节软骨退化;绿色箭头,滑膜增生;黑箭头,软骨下硬化。n个 = 5.比例尺,200微米。c(c)使用OARSI评分系统进行分析,以评估接受AAV5-GFP(对照)或AAV5-miR-204注射的小鼠膝关节AC破坏情况。n个 = 5.Mann−Whitney试验。关节内注射AAV5-miR-204可降低OA引起的疼痛敏感性。在9个月大的小鼠中进行von Frey试验,这些小鼠在3个月大时接受AAV注射。n个 = 6e(电子)接受AAV注射的骨关节炎关节中Runx2、Adamts5和MMP13表达的IHC结果。红色箭头,IHC-阳性细胞。比例尺,50微米。(f)小时每毫米正IHC信号的量化2检测Runx2的膝关节((f)),Adamtas5()和MMP13(小时).n个 = 3.未付款学生的t吨测试*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001
图7
图7
Runx2不足减轻dKO小鼠的OA表型。9个月龄tKO的典型组织学图像(miR-204型弗洛克斯/弗洛克斯;miR-211型弗洛克斯/弗洛克斯;运行2+/(f)液氧;Prx1-芯)小鼠与dKO的比较(miR-204型弗洛克斯/弗洛克斯;miR-211型弗洛克斯/弗洛克斯;Prx1克里)和控制(miR-204基因弗洛克斯/弗洛克斯;miR-211型弗洛克斯/弗洛克斯)老鼠。黄色箭头,关节软骨退化;绿色箭头,滑膜增生;黑箭头,软骨下硬化。n个 = 5.比例尺,200微米。b条Runx2的IHC结果(b条),亚当斯5(c(c))和MMP13()在对照组、dKO和tKO小鼠中表达。红色箭头、Runx2-、Adamts5-或MMP13-阳性细胞。比例尺,50微米

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