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.2019年6月28日；10(1):2854.
doi:10.1038/s41467-019-10786-w。

SETD1A通过调节有丝分裂基因表达程序防止衰老

Ken Tajima先生 1 2 三, 松田佐治 1 2 4, Toshifumi Yae先生 1 2, 本杰明·德拉普金 1 5, 罗伯特·莫里斯 1, Myriam Boukhali公司 1, 基拉·尼德霍夫 1, Valentine Comails公司 1, 塔罗尼什·杜巴什 1, 琳达·尼曼 1, 郭洪山 1, Neelima K C Magnus公司 1, 尼克·戴森 1, Toshihiro Shioda先生 1, 威廉·哈斯 1, 丹尼尔·哈伯 1 5 6, 什亚马拉·马赫斯瓦兰 7 8
附属公司

SETD1A通过调节有丝分裂基因表达程序防止衰老

Ken Tajima先生等。 国家公社. .

摘要

SETD1A是一个在转录活性启动子上维持组蛋白H3-赖氨酸-4（H3K4）甲基化的Set1/COMPASS家族成员，在乳腺癌中过度表达。这里，我们表明SETD1A支持有丝分裂过程，因此，它的敲除导致衰老。SETD1A通过启动子H3K4甲基化调节几个调控有丝分裂和DNA损伤反应的基因，其缺失导致染色体错位和分离缺陷。SETD1A击倒衰老细胞中的细胞周期阻滞与已知衰老介质p53、RB和p16的突变无关；相反，它是通过SKP2的转录抑制来维持的，SKP2降解p27和p21。通过恢复SKP2表达逃逸衰老的罕见细胞显示出基因组不稳定性。在200多个癌细胞系和原代循环肿瘤细胞中，SETD1A的表达与促进有丝分裂和细胞周期的基因相关，这表明SETD1A在抑制异常有丝分裂诱导的衰老中具有广泛作用。因此，SETD1A对维持有丝分裂和增殖至关重要，其抑制释放衰老的肿瘤抑制效应。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
SETD1A的表达保护细胞不衰老。一 设置1A在乳腺癌中被放大。935例乳腺癌的公开数据(http://www.cbioportal.org/)被评估为设置1A基因扩增。图中显示了乳腺导管和小叶混合癌（MDLC）、浸润性导管癌（IDC）和浸润性小叶癌（ILB）的扩增频率。IBC代表浸润性乳腺癌。以单细胞分辨率对小鼠乳腺癌患者来源异种移植物的克隆进化进行了研究，结果表明24%的肿瘤表现为设置1A基因扩增（BCCRC-Xeno）。源数据作为源数据文件提供。b条Kaplan–Meier分析用于绘制SETD1A高表达（上三分位）和低表达的激素受体阳性乳腺癌患者的总体生存率。第页使用对数秩检验（Logrank p = 0.0035; 人力资源 = 5.03（1.51–16.8）。c（c）SETD1A缺失导致衰老。左：感染shGFP和shSETD1A的MDA-MB-231细胞的相对增殖。shSETD1A（设置1A）av（平均值）表示感染两种不同shSETD1A结构的细胞的平均值。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。右图：显示了ß-gal染色对照（shGFP）和SETD1A-KD（shSETD1A）MDA-MB-231细胞的图像。比例尺代表50 微米。d日条形图显示了感染shSETD1A和shGFP的MDA-MB-231培养物中ß-gal阳性细胞的百分比。shSETD1A（设置1A）av（平均值）表示感染两种不同shSETD1A结构的细胞的平均值。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05通过双尾非配对学生t检验。源数据作为源数据文件提供。电子SETD1A-KD细胞中的衰老相关分泌表型（SASP）。RNA显示对数2倍变化 > 1（FDRq个价值 > 用GSEA分析SETD1A-KD（与shGFP相比）MDA-MB-231和A549细胞中的细胞因子和趋化因子活性。提供了有助于每个通路和FDR q值富集的基因。（f）SETD1A-KD细胞中SASP的蛋白质组分析。显示对数2倍变化的蛋白质 > 1（FDRq个价值 > 10%）通过GSEA分析细胞因子和趋化因子活性的富集。提供了有助于每个通路和FDR q值富集的基因的折叠诱导
图2
图2
SETD1A-KD诱导衰老不依赖于第53页和皇家银行状态。一SETD1A-KD不诱导细胞凋亡。在SETD1A-KD作用3天和7天后，分析蛋白质的裂解caspase-3（A549和MDA-MB-231）和裂解PARP（A549）的表达。紫外线照射的细胞显示为阳性对照，阳性对照中裂解的caspase-3和裂解的PARP片段用箭头突出显示。ß-actin用作加载控制。源数据作为源数据文件提供。b条SETD1A-KD不会改变全球H3K4甲基化。对shGFP-和SETD1A-KD-MDA-MB-231细胞进行H3K4Me1、H3K4Me2、H3K4Me3和总组蛋白3表达分析。源数据作为源数据文件提供。c（c）条形图显示ß-gal阳性细胞的定量（平均值 + SD）在感染shSETD1A和shGFP的多发性乳腺癌（MCF7、MDA-MB-468、BT549、MDA-MB-231）和肺癌（HT1299、A549）细胞系中表达。的突变状态第53页,皇家银行,第16页和K-Ras公司在这些细胞系中如下所示。wt野生型、del缺失、mut突变、wt/ovxp野生型或过表达。shSETD1A（设置1A）av（平均值）表示感染两种不同shSETD1A结构的细胞的平均值。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供
图3
图3
SETD1A调节有丝分裂、细胞周期和DNA损伤反应基因。一左图：SETD1-KD A549和MDA-MB-231细胞的转录组分析确定了345个基因在两个细胞系中受到抑制（补充图3a）。以shGFP细胞为对照。将这345个基因与SETD1A-KD细胞中抑制的3258个H3K4甲基化标记进行比较，确定了53个直接的SETD1A靶点（补充图第3a段）。右图：53个SETD1A靶点富含与有丝分裂、细胞周期调节和DNA损伤反应有关的靶点。显示了有助于每个通路和FDR q值富集的基因。b条依赖SETD1A的癌细胞对参与细胞周期和有丝分裂的基因失活敏感。左图：根据阿基里斯计划（DEMETER v2.20.2基因得分）的测量，17079个基因依赖性与285个癌细胞系的SETD1A依赖性相关，进行了排名。绘制每个基因的皮尔逊系数与对数FDR（灰色），并突出显示显著的直接相关（绿色，FDR<1%). 右图：106个基因依赖性上的GSEA与SETD1A依赖性最相关（图2b左侧的黑色方块）。显示了前10个最重要的重叠，占所分析基因的57%。7/10 GO基因集与姐妹染色单体的内聚性有关。c（c）对41个乳腺癌细胞系的高通量定量蛋白质组数据的分析表明，内源性基线SETD1A蛋白表达与有丝分裂、细胞周期和DNA损伤反应相关。描述富含大于对数的蛋白质的细胞景观网络图2（0.5）通过定量MS（GSEA FDR ≤ 0.25; 标称第页价值截止点<0.05). 补充图3d显示了显示与所示过程相关的前沿蛋白质的层次聚类的热图。全套基因富集结果见补充表1。d日转移性乳腺癌患者CTC中SETD1A的表达与参与细胞周期、有丝分裂和DNA损伤反应的SETD1A靶点的表达相关。图中显示了为图中所示的每个基因特征识别的前缘基因之间的皮尔逊相关系数(一)乳腺癌患者单个CTC的RNASeq数据中SETD1A的表达,. The第页提供了每个路径的值。源数据作为源数据文件提供
图4
图4
正确的有丝分裂需要SETD1A表达。一用抗微管蛋白抗体（绿色）和核染色剂DAPI（红色）对MDA-MB-231细胞进行染色。SETD1A-KD培养中染色体分离缺陷引起的微核以虚线圆圈突出显示。比例尺代表20 微米。条形图中提供了微核/染色体分离缺陷细胞分数的量化。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。b条用CREST蛋白抗体对shGFP-和shSETD1A-MDA-MB-231细胞进行染色，以标记着丝粒（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。显微照片显示，中期增加板厚时染色体排列不良。比例尺代表5 微米。源数据作为源数据文件提供。c（c）,d日用微管蛋白抗体对shGFP-和shSETD1A-MDA-MB-231细胞进行染色，以标记微管（绿色）。细胞核用DAPI（红色）染色。染色体排列错误的有丝分裂细胞(c（c）)和滞后染色体(d日)如图所示。虚线圆圈突出显示shSETD1A单元中的缺陷。shGFP细胞显示为对照。比例尺代表5 微米。源数据作为源数据文件提供。电子——克：条形图提供了中所示每个事件的量化(b条——d日). 在三个实验重复中，在每个类别下评估的有丝分裂细胞的总数如下。shSETD1A（设置1A）av（平均值）表示感染两种不同shSETD1A结构体后得出的平均值。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。小时 我-谷氨酰胺停药可阻断MDA-MB-231细胞的增殖。每个数据点代表三个独立实验的数据，以平均值表示 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。我抑制增殖可减轻SETD1A-KD诱导的衰老表型。在存在和不存在L-谷氨酰胺的情况下生长的SETD1A-KD细胞的衰老（24天后再次添加谷氨酰胺） 使用ß–gal染色法测量SETD1A-KD后的小时。shGFP和shSETD1A中ß-gal阳性衰老细胞的定量av（平均值）文化。第1A页av（平均值）表示对每个shSETD1A构造使用两个不同的shSETD1Aknowdown构造的平均值。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供
图5
图5
SKP2系列在SETD1A-KD细胞中调节衰老相关的细胞周期阻滞。一shGFP-和SETD1A-KD细胞的Western blot分析显示p21和p27的诱导。ß-actin显示为控件。在每个印迹下面提供条带的定量。b条SETD1A-KD抑制SKP2表达。左：条形图显示shGFP对照细胞和shSETD1A细胞中SKP2 mRNA的定量。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。右：shGFP对照细胞和SETD1A-KD细胞中SETD1A和SKP2蛋白的Western blot分析。ß-actin显示为控件。源数据作为源数据文件提供。c（c）左图：H3K4Me3标记在SKP2系列在对照（shGFP）和SETD1A-KD细胞中使用跨越该区域的10个引物（P1–P10）进行分析。结果表明，SETD1A-KD抑制了H3K4Me3标记SKP2系列发起人。右：条形图显示了用引物P6和P7评估的启动子区域中SETD1A结合的定量。shSETD1A数据点表示对分别感染两种不同shSETD1A结构的细胞进行的ChIP分析得出的平均值。数据表示为平均值 ± 三个实验重复的平均值SD*第页<0.05作者：Mann–Whitney单位测试。源数据作为源数据文件提供。d日SKP2在SETD1A-KD细胞中的过度表达抑制p27和p21的诱导。在多西环素诱导SKP2表达（Dox + ). 显示了在有和无SKP2诱导的细胞中以及在有和没有SETD1A-KD的细胞中p21和p27蛋白的表达。ß-actin显示为负载控制。源数据作为源数据文件提供。电子SKP2的过度表达拯救了衰老表型。诱导SKP2表达后，细胞中SETD1A表达被抑制（Dox + ) 计数ß-Gal阳性细胞。条形图显示SETD1A-KD后未诱导和SKP2诱导的细胞中ß-gal阳性细胞的百分比。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供
图6
图6
SETD1A-KD细胞在长时间培养后可以避免衰老。一培养90天以上的SETD1A-KD细胞显示ß-gal阳性细胞比例降低。ß-gal染色对照（shGFP）和SETD1A-KD MDA-MB-231细胞的图像，这些细胞衰老（SETD1A-KD后5天）或在长期培养后逃避衰老( > 90天）。比例尺代表50 微米。源数据作为源数据文件提供。b条SETD1A-KD细胞5天后（衰老）或维持5天后的细胞周期分析 > 培养90天（衰老-景观）。与SETD1A-KD衰老细胞表现出的G1细胞周期阻滞相比，逃逸细胞显示出重新进入细胞周期。补充图6b显示了SETD1A-KD衰老和逃逸培养物中细胞周期各阶段的细胞数量。c（c）条形图显示了ß–gal阳性细胞的百分比（平均值 + SD）在5天后（衰老）或 > SETD1A-KD的90天（逃逸）。shGFP转导的细胞显示为两种条件下的对照。来自两个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05通过双尾非配对学生t检验。源数据作为源数据文件提供。d日微管蛋白（绿色）和DAPI（洋红）染色的细胞共聚焦图像显示，逃避衰老的SETD1A-KD细胞存在染色体分离缺陷，表现为微核（圆形）。比例尺代表50 微米。源数据作为源数据文件提供。电子SETD1A-KD细胞微核定量（平均值 + SD）在衰老-景观条件下如下所示。显示shGFP用于控制。每个样本十个不同字段的数据显示为平均值 + SD*第页<0.05（双尾未成对学生）t吨测试。源数据作为源数据文件提供。（f）逃避衰老的SETD1A-KD细胞中SKP2 mRNA表达恢复。条形图显示了SETD1A-KD 5天（衰老）和90天（逃逸）后细胞中SKP2 mRNA的定量。shGFP转导的细胞中SKP2的表达显示为对照。来自三个独立实验的数据表示为平均值 + SD*第页<0.05通过双尾非配对学生t检验。源数据作为源数据文件提供
图7
图7
SETD1A维持增殖和衰老之间的平衡。SETD1A的抑制导致有丝分裂缺陷，这些细胞中SKP2的同时抑制导致缺陷子细胞进入衰老，p21和p27水平增加。SETD1A-KD细胞逃避衰老，通过上调SKP2和其他机制重新进入细胞周期。插图总结了SETD1A表达在维持有丝分裂和衰老之间的平衡中的关键作用
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