Lysine-Specific Histone Demethylase 1A Regulates Macrophage Polarization and Checkpoint Molecules in the Tumor Microenvironment of Triple-Negative Breast Cancer

doi:10.3389/fimmu.2019.01351

.2019年6月12日10:1351。

doi:10.3389/fimmu.2019.01351。 2019年eCollection。

赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A调节三阴性乳腺癌肿瘤微环境中巨噬细胞极化和检查点分子

阿贝尔·H·Y·谭¹, 涂文娟¹, 罗伯特·麦考格¹, 克里斯汀·哈迪¹, 托马西娜·多诺万¹, 索菲亚·钦巴柳克², 杰德·K·福伍德², 苏达·拉奥¹

附属公司

¹表观遗传学和转录实验室Melanie Swan纪念翻译中心，科技，堪培拉大学，澳大利亚首都堪培拉。
²澳大利亚新南威尔士州瓦加瓦加查尔斯·斯图特大学生物医学学院。

PMID： 31249575
预防性维修识别码： PMC6582666型
内政部： 10.3389/fimmu.2019.01351

赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A调节三阴性乳腺癌肿瘤微环境中巨噬细胞极化和检查点分子

阿贝尔·H·Y·谭等。前部免疫球蛋白. 2019.

.2019年6月12日10:1351。

doi:10.3389/fimmu.2019.01351。 2019年eCollection。

作者

阿贝尔·H·Y·谭¹, 涂文娟¹, 罗伯特·麦卡伊格¹, 克里斯汀·哈迪¹, 托马西娜·多诺万¹, 索菲亚·钦巴柳克², 杰德·K·福伍德², 苏达·拉奥¹

附属公司

¹表观遗传学和转录实验室Melanie Swan纪念翻译中心，科技，堪培拉大学，澳大利亚首都堪培拉。
²澳大利亚新南威尔士州瓦加瓦加查尔斯·斯图特大学生物医学学院。

PMID： 31249575
预防性维修识别码： PMC6582666型
内政部： 10.3389/fimmu.2019.01351

摘要

巨噬细胞在调节肿瘤微环境（TME）中起着重要作用。在这里，我们发现经典（M1）巨噬细胞极化降低了LSD1、核REST辅阻遏物1（CoREST）和锌指蛋白SNAIL的表达。LSD1抑制剂吩嗪靶向LSD1的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和CoREST结合域，而LSD1抑制物GSK2879552仅靶向FAD域。吩嗪处理降低了核去甲基酶活性，并增加了M1样信号的转录和表达在体外在小鼠三阴性乳腺癌模型中。总的来说，LSD1抑制剂吩嗪和GSK2879552是剖析LSD1脱甲基酶活性和核LSD1-CoREST复合体对巨噬细胞极化程序切换的贡献的有用工具。这些发现表明，抑制剂必须具有双重FAD和CoREST靶向能力，才能成功启动或激发巨噬细胞向三阴性乳腺癌中的抗肿瘤M1样表型转化。

关键词：CoREST；LSD1；乳腺癌；表观遗传学；巨噬细胞极化；肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤微环境。

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数字

图1
吩嗪靶向LSD1的FAD结构域，并可能破坏LSD1/CoREST轴，导致LSD1及其核活性失稳。**（A）**LSD1蛋白晶体（顶面板）在无吩嗪（左）和有吩嗪的情况下生长（中），GSK2879552（右）。在没有抑制剂的情况下，观察到与FAD辅因子一致的强密度（底部面板）（显示为用炭黑、氮蓝、氧红和磷酸橙着色的棒状物）。该图是一个模拟退火省略图，用于2.5σ等高线的FAD。LSD1为灰色，以卡通模式显示。酚嗪（中）和葛兰素史克（右）对FAD的修饰得到了强密度的支持，对应的图谱和颜色如LSD1:FAD所示。**（B）**在酚嗪和GSK不存在和存在的情况下LSD1的结构叠加。本研究中解决的结构（左图）、单独的LSD1（粉红色）（PDB 6NQM）、LSD1:GSK（黄色）（PDB 6NQU）和LSD1:吩嗪（绿色）（PDB 6NR5）以卡通模式表示。这些结构叠加在左侧面板中，显示了所有三种结构在LSD1催化域中的高度结构同源性。仅LSD1和LSD1:GSK在α-螺旋尾巴中也表现出高度的结构保守性；然而，LSD1:phenelzine在该区域的位移为5.4º。该区域对于CoREST绑定很重要，如中间面板（PDB2UXX）所示。左侧和中间面板中所有结构的叠加显示在右侧，突出显示CoREST绑定是由这些域的正确位置介导的。所有图像均在Pymol中生成。**（C）**ImageJ的plot-profile特征被用来沿着跨越细胞核的单线绘制荧光信号强度(n个=每个核5行，5个单个细胞），使用SE线上每个点绘制的指示抗体对的平均荧光信号强度。**（D）**皮尔逊相关系数（PCC）表示LSD1/CoREST和CoREST/SNAIL的共定位。^*第页< 0.05,^**第页< 0.005,^***第页< 0.0005,^****第页<0.0001曼·惠特尼t吨-测试。

图2
吩嗪或M1极化上调M1蛋白CD38并靶向LSD1的核活性。用LPS+IFN-γ、IL-4或500μM吩嗪或GSK处理RAW264.7细胞24小时**（A）**F4/80中的EGR2和CD38⁺共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行定位。使用Olympus-ASI自动显微镜和运行ASI软件的100x油浸透镜获得单个0.5μm光学切片。最终图像是通过使用带有ASI光谱捕获软件的高通量自动工作台获得的。使用自动ASI软件分析数字图像，通过自动阈值和背景校正自动确定分布和强度。图形表示单个细胞强度的点图或平均TFI(n个=2000个单元格）。**（B）**未经处理、M1/M2极化或用吩嗪、GSK或LSD1抑制剂tranylcypromine处理的RAW264.7细胞核提取物的LSD1活性测定。**（C）**用溶媒对照、LPS+IFN-γ（M1）和IL-4（M2）处理24小时的RAW264.7细胞图像。吩嗪和GSK处理的细胞在24小时内未显示形态变化（数据未显示）。相比之下，用吩嗪或葛兰素史克处理细胞7天。

图3
LSD1可以调节与巨噬细胞极化相关的基因朝向M1表型和检查点分子。RAW264.7细胞未经处理或用LPS+IFN-γ（M1）、IL-4（M2）或500μM吩嗪或GSK处理24小时**（A）**M1相关基因和**（B）**M2相关基因用于比较不同治疗组。图形表示为根据GAPDH标准化的mRNA水平。图表显示平均值±SE（n=3）。^*第页< 0.05,^**第页<0.005 Mann-Whitney t检验。**（C）**和**（D）**显示启动子中基因的染色质可及性**（C）**和enchancer（D）使用FAIRE样本使用定量实时PCR的相关基因区域。**（E）**10nM LSD1 siRNA转染的细胞和**（F）**检测点分子和用于比较不同治疗组。

图4
吩嗪治疗使肿瘤微环境中的巨噬细胞极化为M1表型。**（A）**使用BALB/c 4T1乳腺癌模型的治疗方案。**（B）**使用载体对照、阿布沙星、吩嗪或PD1治疗的小鼠肿瘤体积(n个= 4/5).（C）TME中总巨噬细胞、炎性巨噬细胞和M2样巨噬细胞的流式细胞术。^*第页<0.05，曼·惠特尼t吨-测试(n个= 4/5). 的代表性图像**（D）**M1和**（E）**4T1小鼠模型FFPE肿瘤组织M2染色。**（F）**固定原发性4T1肿瘤切片，IF显微镜用M1聚焦的一级抗体检测F4/80、iNOS、CD86和PDL1的DAPI（绿色=F4/80红色=iNOS，黄色=CD86，青色=PDL1，蓝色=DAPI）。使用ASI的mIF系统测量iNOS、CD86和PDL1阳性的F4/80细胞的群体百分比。显示了每个数据集的代表图像。图表示人口百分比(n个每组≥500个细胞，n个=4只小鼠）。**（G）**将原发性4T1肿瘤切片固定，IF显微镜用M2聚焦的一级抗体检测F4/80、EGR2、CD206和PDL2的DAPI（绿色=F4/80红色=EGR2，黄色=CD206，青色=PDL2，蓝色=DAPI）。使用ASI的mIF系统测量EGR2、CD206和PDL2阳性的F4/80细胞的群体百分比。显示了每个数据集的代表图像。图表示人口百分比(n个每组≥500个细胞，n个=4只小鼠）。

图5
TME中巨噬细胞分离RNA的纳米线计数（log2 fold-change）**（A）**M1表型特征和途径，**（B）**M1信号分子和转录因子，**（C）**T细胞激活基因特征，以及**（D）**CD169号⁺巨噬细胞基因特征。^*表示Benjamini–Yekutieli错误发现率值<0.05。

图6
CpG含量、GC含量、组蛋白标记和NanoString面板中基因的可及性。**（A）**CpG和GC含量，**（B，D）**组蛋白水平和**（C）**在RAW264.7细胞中，NanoString基因转录起始位点（TSS）上调、下调（FDR<0.15）或不变（FDR>0.15）的基因和refSeq基因的可及性为±1 kb（47）。**（C）**显示了在LPS刺激或不刺激6小时的情况下，Nanostring基因对来自骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的基因集的可及性（48）。**（E）**上调/下调NanoString基因的水平，这些基因的增强子位于BMDM TSS的10 kb以内，无论是否有24小时LPS刺激（31）。A类t吨-不等方差检验（韦尔奇两个样本t吨-test）用于^*第页< 0.05,^**第页<0.01和^***第页< 0.001.

图7
吩嗪影响河马、Wnt和Ras信号通路以及与ECM重塑和代谢相关的基因。**（A）**热图显示使用默认值和**（B）**KEGG路径注释。非定向得分衡量的是基因集的基因与对照组的差异表达程度，而忽略了集合中的每个基因是上调还是下调。橙色表示其基因相对于对照表现出广泛差异表达的基因集，蓝色表示差异表达较少的基因集。定向得分衡量基因集与对照组相比上调或下调的程度。红色表示广泛过度表达的基因集，蓝色表示广泛表达不足的基因集。**（C）**维恩图显示了错误发现率<0.05的差异表达基因（Benjamini-Yekutieli）以及这些基因所属的前6条通路。**（D）**表中显示了阿布烷和吩嗪特有的上调和下调基因。

图8
LSD1如何重新编程巨噬细胞极化的假定模型。**（A）**当巨噬细胞受到LPS和IFN-γ（经典激活；M1）刺激时，CoREST的破坏会破坏LSD1的稳定性，从而导致LSD1失去其调节M1相关基因的抑制作用。它还增加LSD1脱甲基酶活性。**（B）**当巨噬细胞受到IL-4（选择性激活；M2）刺激时，CoREST不受影响，导致LSD1p和LSD1稳定表达，维持其在调节M1相关基因中的抑制作用。它还降低LSD1脱甲基酶活性。**（C）**使用吩嗪抑制LSD1可以同时针对LSD1p和CoREST，模拟对M1极化的类似反应，而**（D）**GSK无法实现相同的结果，因为它没有中断LSD1/CoREST复合体。

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