跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2019年6月27日;2(4):e201900305。
doi:10.26508/lsa.201900305。 2019年8月印刷。

人类器官型脑片培养:神经肿瘤学环境研究的新框架

附属公司

人类器官型脑切片培养:神经肿瘤学环境研究的新框架

维迪亚·拉维等。 生命科学联盟. .

摘要

当涉及到人脑时,缺乏与活体条件密切模拟的模型。活神经元组织是活体人脑体外最接近的表现形式。在这里,我们提出了一种方法,该方法可用于长期维持治疗性切除的健康神经组织,而组织活力无任何明显变化,这可以通过免疫组织化学、基因表达和电生理学证明。然后,通过将患者来源的肿瘤细胞微量注射到培养切片中,使用该方法评估胶质母细胞瘤(GBM)在自然环境中的进展。结果与肿瘤新生生长和侵袭模式、药物治疗反应和细胞因子环境非常相似。星形胶质细胞的反应性转化,作为细胞非恶性肿瘤环境的一个例子,可以用与急性GBM标本分离的星形胶质细胞相似的转录差异来精确模拟。简而言之,我们提出了一种在生理环境中研究GBM的简单方法,从中可以获得有价值的见解。这项技术可以促进神经科学、神经肿瘤学和药物治疗的进一步发展。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1。
图1.组织采集验证。
(A)本研究使用了26名患者(5名癫痫患者和21名肿瘤患者)的神经组织样本。(B)参与本研究的组织捐赠者年龄密度图。(C)本研究所用组织的解剖区域分布来源于(额叶:31%,顶叶:8%,枕叶:8%和颞叶:54%)。(D)在手术前进行术前规划,以确定肿瘤手术期间切除的进入皮层的“健康”状态。与浸润皮层有2 cm的安全距离,以避免受到GBM细胞的污染。
图2。
图2.工作流程图。
(A)苏木精和伊红染色证实肿瘤浸润的皮层与健康皮层相对分离。微血管增生(黑色箭头)见于(i)肿瘤组织和(ii)健康皮层。(B)生成用于器官型脑培养的切片的工作流插图。使用振动仪从每个1×2-cm组织块中获得18–20个300μm厚的冠状切片,尺寸为~10×15mm。然后使用钝块将切片转移到六孔板中插入物的尼龙膜上,将玻璃巴斯德移液管的末端火焰抛光,并在37°C下培养,介质表面接触膜,使扩散达到14天。然后使用(i)MEA电生理学来确定神经元活动,(ii)在不同时间点对切片进行表征免疫组织化学用于评估细胞组成和随时间的丢失,(iii)ELISA用于评估细胞损伤或细胞因子测量,以及(iv)MinION RNA-sequencing/qPCR用于评估基因表达的剖面变化。
图3。
图3人脑切片模型的活力量化。
从每批中收集急性切片作为对照。然后将培养数周的切片与急性切片进行比较,N=20名患者。(A)从左至右:急性、DIV1、DIV4、DIV7和DIV14组织切片的5×平铺代表性荧光图像。切片对比神经元标记物(NeuN)、星形胶质细胞标记物(GFAP)和细胞核(DAPI荧光计数)。比例尺为1 mm;每个时间点的代表性5×图像显示了切片的细胞结构。比例尺为200μm;每个时间点的代表性20×图像,显示神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)和细胞核(DAPI)。比例尺为50μm。(B–E)NeuN(神经元)阳性染色的量化显示,新鲜切片与培养切片之间的神经元切片分布存在显著差异(P(P)< 0.0001). (C) 神经元丢失率的量化显示,与DIV1-14相比,神经元丢失率几乎没有降低。(D) GFAP(星形胶质细胞)定量显示,由于损伤,新鲜切片与DIV1相比增加(P(P)<0.00001),(E)星形胶质细胞丢失的量化显示DIV1到14之间无显著差异(DIV4=−5.97%,DIV7=−8.15%,DIV14=5.58%,采用Bonferroni校正的单向方差分析进行多重比较)。(F)采用TUNEL分析法对N=3名患者在不同时间点进行脑片培养中的细胞坏死。(G)TUNEL阳性细胞的定量显示DIV1到14之间无显著差异(DIV4=6.74%,DIV7=11.35%,DIV14=0.613%)。(H)在不同的时间点使用LDH测定量化细胞代谢。(I)LDH定量分析显示DIV1至14之间无显著差异(DIV4=33.87%,DIV7=34.51%,DIV14=26.31%)。使用未配对的用韦尔奇的修正进行测试*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.001, ***P(P)< 0.0001, ****P(P)<0.00001,ns=无显著性。显示了三个独立实验的代表性结果(误差栏表示±SD)。
图4。
图4:通过多电极阵列进行电生理活动分析。
(A)实验工作流的图示。切片培养至DIV14,并进行记录以评估电生理活性。如图所示,将节段放置在记录阵列上。通过高钾灌注诱发神经活动+中等。(B)对记录的数据进行高通量过滤(300 Hz),提取神经元事件并在绘图前求平均值(红色:DIV1,蓝色:DIV14)。(C)细胞外电生理记录的随机取样。
图5。
图5基因表达分析。
(A)使用纳米孔MinION对约500 mg组织进行RNA-seq实验的工作流程。在规定的培养期后,对N=3名患者的组织进行均质化、RNA提取、扩增、文库制备和序列测定。(B)差异体基因表达显示前500个上调和下调基因。前500个上调和下调基因位于同一表达区域。(C)比较不同时间点的基因表达谱。基因表达谱显示了从急性到DIV7的表达变化。然而,与DIV7和DIV14相比,表达谱保持稳定。(D–G)神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞特异性表达谱。每个细胞类型的关键基因显示在表达图旁边的虚线框中。根据信度得分选择细胞特异性签名。y轴的比例尺是全局的,如(B)所示。
图S1。
图S1.基因表达分析。
(A)RNA测序基因表达分析的散点图;在x轴上,给出了DIV7和14的平均表达式;在y轴上显示急性切片的基因表达。相关性为R=0.95,P(P)<0.001,未发现显著差异表达基因。颜色表示来自细胞基因特征的基因。(B)基于细胞特征基因,计算分数以量化切片中细胞成分的损失*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001。
图6。
图6人类GBM模型。
(A)DIV1上肿瘤注射和肿瘤进展的实验工作流程图解通过成像进一步验证。(B)(i) TMZ敏感原神经细胞GSC_CL1在培养14天以上的增殖模式。(ii)向培养基中添加TMZ(50μM)时,增殖模式被破坏。将GBM细胞注射到切片(DIV4)后3d,将TMZ添加到培养基中。(C)比例尺为200μm。(C) (i)间充质细胞型GSC_CL2在14天内的增殖模式。(ii)向培养基中添加TMZ(50μM)时,增殖不间断。将GBM细胞注射到切片(DIV4)后3d,将TMZ添加到培养基中。比例尺为200μm。(D)GSC:CL1和GSC:CL2的注射肿瘤面积增加的量化显示GSC:CL2的+59.2%的变化,而GSC:CL1的+32.3%,P(P)<0.0001,并且在50μM TMZ的存在下,GSC_CL1表现出生长停滞,而GSC_CL2表现出对治疗的轻微反应。(E)使用双光子显微镜进行3D成像和重建。左侧图像显示GSC_CL1和GSC_CL2的肿瘤核心,右侧图像表示GSC_CL.1和GSC-CL2的肿瘤浸润边缘。比例尺为50μm。未付款采用了韦尔奇校正试验。
图S2。
图S2 DIV14后肿瘤迁移的可视化。
(A、B)图中显示,DIV14后,原神经细胞型GSC_CL1仅迁移至切片边界,(B)而间充质细胞类型GSC_CL2迁移至切片边缘以外并感染Millipore嵌件。比例尺为200μm。
图S3。
图S3.胶质瘤细胞迁移和胶质瘤模型中细胞类型的存在。
(A)图中显示,DIV7后,前神经GSC_CL1细胞型仅侵入白质区域,并避开皮层,而间充质GSC_CL2细胞型同时侵入白质和皮层。比例尺为200μm。(B)肿瘤环境(肿瘤细胞,pZsGreen)中星形胶质细胞(GFAP,白色)和神经元(NeuN,红色)切片的免疫组织化学显示了切片的活力。比例尺为50μm。
图S4。
图S4.胶质瘤模型中血管系统的可视化和量化。
从人体组织标本制备振动切片(300μm),孵育2周,然后固定并染色以检测IV型胶原抗体。(A)从上到下:显示急性、对照DIV14、DIV14 GSC:CL1和DIV14的GSC_CL2切片,并对IV型胶原抗体(红色)、肿瘤(pZsGreen)和DAPI(蓝色)进行染色。比例尺为50μm。(B)(i–iv)显示急性、对照DIV14、DIV14 GSC:CL1和DIV14 GSC:CL2血管的交点数(y轴)和3D距离。
图7。
图7不同GBM细胞类型的细胞因子谱:注射和不注射肿瘤的切片的细胞因子环境。
细胞因子谱分析表明,由于TME的发展,使用Bonferroni的多重比较试验进行单向方差分析,切片中有显著变化*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.001, ***P(P)< 0.0001, ****P(P)< 0.00001.
图8。
图8.使用离体模型的星形细胞图谱。
(A)从培养切片中提取星形细胞的方案。用生物素标记抗体提取星形胶质细胞。(B)标记提取的星形胶质细胞的不同反应状态的标志性星形胶质细胞基因的基于qPCR的热图。特征基因是从公开的数据集中提取的。(C)通过对人的特异性和星形细胞忠诚度评分选择的反应性标记基因在GBM患者纯化的星形细胞和我们的肿瘤注射人切片模型中的表达分析。
图S5。
图S5.使用FACS量化样品中的肿瘤细胞污染。
为了使用GLAST抗体检查提取的星形胶质细胞的纯度,进行了FACS分析。(A、B)获得的数据最初针对72.28%的FSC面积与SSC面积的细胞类型人群进行门控,然后针对FSC面积和FSC宽度的单株(86.97%)进行门控。(C、D)用FSC区和DAPI区对活细胞(83.39%)进行门控,最后(D)用pZsgreen区和GLAST区对肿瘤细胞进行门控。图中显示,用于提取星形胶质细胞的样品中,肿瘤细胞的比例小于0.05%。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Alexander BM,Cloughesy TF(2017)成人胶质母细胞瘤。临床肿瘤学杂志35:2402–2409。10.1200/jco.2017.73.0119-内政部-公共医学
    1. Batash R、Asna N、Schaffer P、Francis N、Schavfer M(2017)多形性胶质母细胞瘤的诊断和治疗;近期文献综述。《现代医学化学》24:3002–3009。10.2174/0929867324666170516123206-内政部-公共医学
    1. Biggs T、Foreman J、Sundstrom L、Regenass U、Lehembre F(2011)《胶质母细胞瘤器官型脑培养中的抗肿瘤化合物测试》。生物素筛选杂志16:805–817。10.1177/1087057111414895-内政部-公共医学
    1. Birch JL、Strathdee K、Gilmour L、Vallatos A、McDonald L、Kouzeli A、Vasan R、Qaisi AH、Croft DR、Crighton D等(2018)一种新型MRCK小分子抑制剂可防止胶质母细胞瘤的辐射驱动侵袭。癌症研究78:6509-6522。10.1158/0008-5472.CAN-18-1697-内政部-公共医学
    1. 比斯尔MJ。(1981)正常和恶性细胞的分化状态或如何在培养中定义“正常”细胞。细胞国际评论70:27–100。10.1016/s0074-7696(08)61130-4-内政部-公共医学

出版物类型

MeSH术语