Generation of pig induced pluripotent stem cells using an extended pluripotent stem cell culture system

doi:10.1186/s13287-019-1303-0

.2019年6月27日；10(1):193.

doi:10.1186/s13287-019-1303-0。

使用扩展的多能干细胞培养系统生成猪诱导的多能效干细胞

徐俊君^1 2, 于乐谦^三 4, 郭建雄⁵, 金竹香¹, 郑正², 登封高^1 2, 冰波石^1 2, Haiyang Hao公司^1 2, 德令焦⁵, 梁忠⁶, Yu Wang（王宇）⁷, 吴军^8 9, 洪江卫^10 11, 韩建勇^12 13

附属公司

¹中国农业大学生物科学学院农业生物技术国家重点实验室，北京，100193。
²中国农业大学生物科学学院，北京，100193。
^三德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯，75390，美国。
⁴美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心哈蒙再生科学与医学中心，邮编75390。
⁵云南省动物基因编辑与克隆重点实验室，昆明，650201。
⁶中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京，100101。
⁷中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室，北京，100101。
⁸得克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，美国得克萨斯州达拉斯，75390。6月2日，wu@utsouthwest.edu。
⁹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心哈蒙再生科学与医学中心，邮编75390。Jun2.wu@utsouthwestern.edu。
¹⁰云南省动物基因编辑与克隆重点实验室，昆明，650201。hongjiangwei@126.com。
¹¹云南农业大学兽医学院，昆明，650201。hongjiangwei@126.com。
¹²中国农业大学生物科学学院农业生物技术国家重点实验室，北京，100193。hanjy@cau.edu.cn。
¹³中国农业大学生物科学学院，北京，100193。hanjy@cau.edu.cn。

PMID： 31248457
预防性维修识别码： PMC6598264型
内政部： 10.1186/s13287-019-1303-0

使用扩展的多能干细胞培养系统生成猪诱导的多能效干细胞

徐俊君等。干细胞研究与治疗. 2019.

.2019年6月27日；10(1):193.

doi:10.1186/s13287-019-1303-0。

作者

徐俊君^1 2, 于乐谦^三 4, 郭建雄⁵, 金珠巷¹, 郑正², 登封高^1 2, 冰波石^1 2, 海洋浩^1 2, 德令焦⁵, 梁忠⁶, Yu Wang（王宇）⁷, 吴军^8 9, 洪江卫^10 11, 韩建勇^12 13

附属公司

¹中国农业大学生物科学学院农业生物技术国家重点实验室，北京，100193。
²中国农业大学生物科学学院，北京，100193。
^三德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯，75390，美国。
⁴美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心哈蒙再生科学与医学中心，邮编75390。
⁵云南省动物基因编辑与克隆重点实验室，昆明，650201。
⁶中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京，100101。
⁷中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室，北京，100101。
⁸德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯，75390，美国。Jun2.wu@utsouthwestern.edu。
⁹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心哈蒙再生科学与医学中心，邮编75390。Jun2.wu@utsouthwestern.edu。
¹⁰云南省动物基因编辑与克隆重点实验室，昆明，650201。hongjiangwei@126.com。
¹¹云南农业大学兽医学院，昆明，650201。hongjiangwei@126.com。
¹²中国农业大学生物科学学院农业生物技术国家重点实验室，北京，100193。hanjy@cau.edu.cn。
¹³中国农业大学生物科学学院，北京，100193。hanjy@cau.edu.cn。

PMID： 31248457
预防性维修识别码： PMC6598264型
内政部： 10.1186/s13287-019-1303-0

摘要

背景：猪已经成为生物医学研究中最受欢迎的大型动物模型之一，在许多情况下，猪被认为是比啮齿动物模型更好的选择。此外，在人体试验之前，使用猪多能干细胞衍生物的移植研究可以作为安全性和有效性的试验台。最近，有研究表明，在LCDM（重组人LIF，CHIR 99021，（S）-（+）-二甲基亚砜马来酸盐，盐酸米诺环素）培养基中培养的小鼠和人PS细胞表现出扩展的发育潜能（称为扩展多能干细胞或EPS细胞），可以在嵌合小鼠胚胎中生成胚胎和胚外组织。在LCDM培养基中能否产生稳定的猪诱导多能干细胞，其嵌合能力尚不清楚。

方法：用编码Oct4、Sox2、Klf4和cMyc重编程因子的逆转录病毒载体感染猪周细胞（PC）和胚胎成纤维细胞（PEF）生成iPS细胞，然后在改良的LCDM培养基中培养。通过检测多潜能相关转录因子和表面标记的表达、转录组分析以及体外和体内分化能力来表征PC-iPS和PEF-iPS细胞的多潜能。还通过荧光显微镜、流式细胞仪和PCR分析评估了PC-iPS细胞对小鼠和猪胚胎的嵌合贡献。

结果：在这项研究中，我们使用改良的LCDM培养基，成功地从PC和PEF中生成了iPS细胞。PC-iPS和PEF-iPS细胞在长期培养后均保持稳定的“圆顶”形态和基因组稳定性。免疫细胞化学分析显示，PC-iPS和PEF-iPS细胞均表达OCT4、SOX2和SALL4，但只有PC-iPS细胞表达NANOG和TRA-1-81（微弱）。PC-iPS和PEF-iPS细胞在体外可分化为所有三个初级生殖层的细胞衍生物。转录组分析表明，PEF-iPS和PC-iPS细胞与猪ICM、Heatmap和火山图聚集，PC-iPS和PEF-iPS细胞之间有1475个差异表达基因（DEGs）（调整后的p值<0.1），PC-iPS细胞中上调基因数为755个，下调基因数为720个。上调基因富含GO术语，包括干细胞分化、增殖、发育和维持的调控。上调基因中KEGG通路的富集揭示了Wnt、Jak-STAT、TGF-β、P53和MAPK干细胞信号通路。使用猪mtDNA特异性引物和GFP引物进行荧光显微镜和基因组PCR分析表明，PC-iPS细胞衍生物可在小鼠和猪植入前胚泡和植入后胚胎中检测到。流式细胞术定量分析表明，猪PC-iPS细胞在小鼠胚胎中的嵌合贡献高达0.04%。

结论：我们的发现表明，在LCDM培养基中可以生成稳定的iPS细胞，这可以在体内生成胚胎和胚外细胞。然而，猪LCDM-iPS细胞的嵌合效率和嵌合水平较低。

关键词：奇美拉；EPS细胞；扩展多能性；猪iPS细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
PC-iPS和PEF-iPS的生成**.a个**Pig iPS生成的示意图。b条PC-iPS和PEF-iPS的生成过程，比例尺200 微米。**c（c）**PC-iPS和PEF-iPS细胞从P1到P4的菌落形态发生变化，从P4到P10的菌落保持稳定的圆顶状，比例尺200 微米。d日PC-iPS和PEF-iPS细胞的碱性磷酸酶染色，比例尺200 微米

图2
PC iPS和PEF iPS细胞的特性**.a个**PC-iPS和PEF-iPS细胞的免疫细胞化学分析，比例尺10 微米。b条PC-iPS和PEF-iPS细胞的核型分析。**c（c）**PC-iPS和PEF-iPS细胞的EB形成，比例尺200 微米。d日体外PC-iPS和PEF-iPS细胞三胚层分化的免疫组织化学，比例尺100 微米。**e（电子）**在圆顶和扁平圆盘状PC-iPS电池之间切换，比例尺200 微米。**（f）**圆顶和扁平圆盘状PC-iPS细胞的RT-PCR分析(****第页 < 0.0001, ***第页 < 0.001, **第页 < 0.5; ns，不显著）

图3
PEF-iPS和PC-iPS的转录组分析。（A，A）PC-iPS细胞、PEF-iPS细胞和猪胚胎不同阶段的热图分析。（A，b）PC-iPS细胞、PEF-iPS细胞和猪胚胎不同阶段的PCA分析。（A，c）在LCDMV培养的PC-iPS和PEF-iPS细胞中内源性和外源性多潜能相关转录因子的表达分析。（A，d）其他多潜能相关基因在PC-iPS和PEF-iPS细胞中的表达分析。（B，a）PC-iPS与PEF-iPS细胞的热图分析(*P（P）* < 0.01). （B，B）PC-iPS与PEF-iPS细胞的火山图。（B，c）PC-iPS与PEF-iPS细胞的GO术语。（B，d）KEGG途径信号通路的富集(****第页 < 0.0001, ***第页 < 0.001, **第页 < 0.5; ns，不显著）

图4
PC-iPS对小鼠晚期囊胚TE和ICM的体外作用**.a个**将GFP标记的PC-iPS细胞注射到4到8细胞胚胎中，比例尺200 20微米微米。b条GFP标记的PC-iPS细胞有助于TE和ICM，比例尺20 微米。**c（c）**20标尺嵌合体小鼠晚期囊胚CDX2和NANOG的免疫细胞化学分析微米

图5
GFP PC-iPS对嵌合体小鼠体内贡献的分析. 一嵌合体小鼠胎儿的典型亮场和荧光图像。b条嵌合小鼠胎儿GFP阳性细胞的流式细胞术分析。**c（c）**嵌合体小鼠胎儿GFP和猪mtDNA的巢式PCR（GFP标记的PC-iPS细胞DNA和PB513B-1质粒用作GFP序列阳性对照；GFP标记PC-iPS的细胞DNA和PC DNA用作猪mtDNA序列阳性对照₂O）并且使用小鼠DNA作为阴性对照）。d日胚胎外组织的代表性亮场和荧光图像。**e（电子）**胚胎外组织中GFP阳性细胞的流式细胞术分析。**（f）**嵌合体小鼠胚外组织GFP和猪mtDNA的巢式PCR。克退化小鼠胚胎的典型亮场和荧光图像，比例尺500 微米

图6
GFP标记的PC iPS细胞有助于体外和体内猪胚胎中嵌合的形成.（A，A）注射有GFP标记的PC iPS细胞的猪胚胎的代表性荧光图像，比例尺10 微米。（A，b）GFP标记的PC-iPS有助于清管器ICM，标尺50 微米。（A，c）GFP标记的PC-iPS细胞有助于猪TE，比例尺50 微米。（B）利用植入后猪胚胎和胚外组织进行GFP巢式PCR分析（GFP标记的PC-iPS细胞DNA和PB513B-1质粒用作GFP序列阳性对照₂O）小鼠DNA作为阴性对照）

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