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.2019年6月26日；10(1):2797.
doi:10.1038/s41467-019-10729-5。

YAP通过反馈调节WT1和Rho家族GTPases促进上皮-间质转化

金硕公园 1, Deok-Ho金 2, 萨加尔·沙阿 三 4, 金洪南 5, 克希提兹 1, 金彼得 2, 阿尔弗雷多·奎尼奥内斯·希诺霍萨 6, 安德烈·列夫琴科 7
附属公司

YAP通过反馈调节WT1和Rho家族GTPases促进上皮-间质转化

金硕公园等。 国家公社. .

摘要

细胞集体迁移发生在许多病理生理状态，包括伤口愈合和浸润性癌生长。扩张的上皮片的完整性取决于细胞外信号，包括细胞间和细胞-基质相互作用。我们表明，上皮细胞层下细胞外基质的纳米级地形可以强烈影响扩张片前部的速度和形态，从而触发部分和完全上皮-间充质转变（EMT）。我们进一步证明，这种行为取决于转录调节器YAP的机械敏感性和两种新的YAP介导的交叉调节反馈机制：Wilms Tumor-1-YAP介介导的E-cadherin下调、细胞间接触松动和YAP-TRIO-Merlin介导的Rho-GTPase家族蛋白调节，增强细胞迁移。这些YAP依赖性反馈回路导致EMT相关标记物的信号和表达发生开关样变化，导致侵袭性细胞扩散的强烈增强，这可能导致肾癌和其他癌症的临床结局恶化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

D.-H.K.是NanoSurface Biomedical Inc.的联合创始人和科学董事会成员。a.L.是Sidera Medicine的联合创始人。其余作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
机械环境的各向异性纹理会增加EMT。一扩张上皮片边缘区域的示意图，包括由“主导”细胞导致的指状突起（FLP）的形成和尖端细胞偶尔分离（“扩散”）。它还定义了本图和后续图中细胞迁移分析的距离度量。插图显示了NRA的电子显微照片。b条单元轨迹着色，以反映平面（顶部）和NRA（底部）上展开板中的单元速度值。每个点的颜色表示相应单元格的平均速度值（左）。轨迹被跟踪了6次 h，每20次测量一次速度 min（右）。c（c）在距板材边缘不同初始距离（对应于d日面板内一). 每个点代表单个单元格的平均速度。虚线表示平坦表面上孤立单个细胞的平均速度（红色）和NRA（蓝色）（每个独立分析细胞的数量，n个，表示# = 边缘区速度与平坦表面（红色）和NRA（蓝色）上细胞的最亚边缘区速度的统计意义，##P（P） < 5 × 10−4和###P（P） < 5 × 10−6, * = 平坦表面上细胞速度与NRA的统计显著性，以及*P（P） < 0.05, **P（P） < 5 × 10−4、和***P（P） < 5 × 10−6).d日每单位长度的上皮片在平坦基底和NRA上的上皮片播散18 小时(n个 = 4个生物独立实验* = 平面传播次数与NRA的统计显著性***P（P） < 5 × 10−6).e（电子）免疫印迹法分析蜗牛在细胞表面的表达及NRA(n个 = 3个生物独立样本* = 扁平基底与NRA基底细胞中蜗牛表达的统计意义*P（P） < 0.05).（f）TGFβ存在时上皮片在平坦基底和NRA上的播散(n个 = 4个生物独立样本* = 对照组与TGFβ组在平坦基底（红色）和NRA（蓝色）上传播次数的统计意义*P（P） < 0.05和**P（P） < 1 × 10−2). 所有误差条均为S.E.M，统计显著性由双边学生t吨-测试
图2
图2
YAP在扩张上皮层中的开关样调节使细胞-细胞粘附松动。一使用YAP和磷酸化YAP抗体通过免疫印迹分析扁平基底和NRA上的细胞。b条单个YAP的细胞迁移速度KD（分子量）和YAP石油当量细胞板中的细胞与NRA上的细胞板边缘的距离有关（每个独立分析的细胞数，n个，表示* = 控制速度与YAP的统计意义KD（分子量）NRA（绿色）和对照组与YAP上的细胞石油当量NRA上的细胞（紫色）*P（P） < 0.05, **P（P） < 5 × 10−4、和***P（P） < 5 × 10−6).c（c）免疫荧光染色检测扁平基底和NRA上上皮细胞片中的YAP和活性β-连环蛋白。观察到YAP和活性β-连环蛋白在NRA（棕色盒子）上扩张的片状边缘区和FLP中的核内移位，以及NRA（红色盒子）和平坦基底上亚边缘细胞中的主要细胞质YAP和活动β-连环素定位。8点后对样本进行分析 h从片材膨胀开始。d日显示不同强度YAP和活性β-连环蛋白染色的细胞核部分，作为与8处测定的薄片边缘距离的函数 板材膨胀开始后h（边缘与面板中FLP底部的凹面区域一致c（c）).e（电子）y方向的速度相关长度，平行于对照组和YAP的上皮扩张方向KD（分子量）平坦基底和NRA上的单元（每个独立分析单元的数量，n个，表示* = 相关长度的统计显著性*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和n.s = 无意义）。（f）在存在E-cadherin功能性阻断抗体的情况下，细胞片中单个细胞的细胞迁移速度与平坦底物和NRA上细胞片边缘的距离有关。带有方形标记的虚线表示隔离对照细胞的平均细胞迁移速度，带有圆形标记的实线表示隔离YAP的平均细胞移动速度KD（分子量）细胞（表示每个独立分析细胞的数量，n# = YAP边缘区与最次边缘区速度值的统计意义KD（分子量）含有药物的细胞，###P（P） < 5 × 10−6. * = 对照组与YAP的统计显著性KD（分子量）含有药物（绿色）和YAP的细胞KD（分子量）有药物与无药物的细胞（黑色）*P（P） < 0.05, **P（P） < 5 × 10−4、和***P（P） < 5 × 10−6).克控制，YAPKD（分子量）和YAP石油当量使用活性β-catenin和E-cadherin抗体对细胞进行免疫印迹。所有误差条均为S.E.M，统计显著性由双边学生t吨-测试
图3
图3
WT1与YAP的亚细胞定位相似。一扁平基底和NRA上上皮细胞片中WT1的免疫荧光染色。在边缘区和NRA（棕色盒）上扩张的片状物的FLP中观察到WT1向细胞核的移位。NRA（红盒）和平坦底物上的亚边缘细胞在细胞质中显示YAP。样品在8 h去除模板。b条控制和YAPKD（分子量）用YAP和WT1抗体进行免疫印迹分析细胞及其核组分。c（c）细胞内WT1的免疫荧光染色d日不同密度细胞核中YAP和WT1丰度的免疫印迹-上皮细胞片显示WT1密度依赖性易位到细胞核
图4
图4
YAP通过NRA上皮层中的WT1调节E-钙粘蛋白。一YAP中WT1的免疫荧光染色KD（分子量）单元格表（顶部），用于WT1中的YAPKD（分子量）在NRA上培养的细胞片。样品在8 h去除模板。b条使用YAP抗体进行Co-IP分析，然后使用WT1抗体进行免疫印迹。c（c）E-cadherin启动子WT1-YAP复合物结合的染色质免疫沉淀（ChIP）分析(n个 = 3). 我们提取交联染色质，并使用针对YAP、WT1、IgG（阴性对照）和RNAPII或组蛋白H3（见图12a）抗体（阳性对照）的抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀染色质和输入的基因组DNA用于扩增E-cadherin启动子、CTGF启动子（已知受YAP而非WT1调节，用作另一个对照）和GAPDH启动子(n个 = 4个生物独立样本* = 每个样本的PCR产物与IgG的统计显著性*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01).d日E-cadherin在对照组和WT1中的表达KD（分子量）用WT1和E-cadherin抗体免疫印迹分析细胞(n个 = 3个生物独立样本* = 对照组和WT1 E-cadherin表达的统计学意义KD（分子量）单元格***P（P） < 5 × 10−3).e（电子）对照组和WT1中单个细胞的细胞迁移速度KD（分子量）在存在E-cadherin阻断抗体的情况下，薄板边缘区域的上皮细胞（每个独立分析的细胞数，n个，表示* = 统计显著性，n.s = 无意义，以及***P（P） < 5 × 10−3).（f）对照组和WT1细胞的传播KD（分子量）存在E-cadherin阻断抗体时NRA上的上皮片(n个 = 4个生物独立实验* = 统计显著性*P（P） < 0.05, ***P（P） < 5 × 10−3和n.s = 无意义）。克不同浓度E-cadherin阻断抗体培养细胞片中磷酸化YAP和总YAP的免疫印迹(n个 = 3个生物独立样本）。小时由NRA产生的机械线索触发的YAP介导的细胞传播示意图，通过YAP-WT1复合物对E-cadherin的控制进行操作，并导致细胞在NRA上的上皮细胞片中传播。所有误差条均为S.E.M，统计显著性由双边学生t吨-测试
图5
图5
YAP通过Rac1促进细胞迁移的作用。一使用在平坦表面上培养的细胞和NRA进行Rac1活性测定(n个 = 3个生物独立样品* = 平坦表面上活性Rac1与Rac1的比率相对于NRA的统计学显著性*P（P） < 0.05).b条控制，YAPKD（分子量）和YAP石油当量通过下拉试验、TRIO表达、PAK和Merlin磷酸化对细胞进行免疫印迹以评估Rac1活性。c（c）YAP中单个细胞的细胞迁移速度KD（分子量）（左）和YAP石油当量（右）在存在Rac1抑制剂NSC23766和TRIO抑制剂ITX3的情况下，NRA上上皮细胞片边缘区域的细胞（显示每个独立分析的细胞数n* = 对照组与YAP的统计显著性KD（分子量）和控制vs.YAP石油当量含药物的细胞，n.s = 没有意义*P（P） < 0.05, **P（P） < 1 × 10−2、和***P（P） < 5 × 10−3). 所有误差条均为S.E.M，统计显著性通过双侧Student t检验确定
图6
图6
NRA上皮层中YAP、Rac1和Merlin的交叉调节。一平表面上皮细胞片和NRA中Merlin的免疫荧光染色。在NRA上片状物的边缘区和FLP中，Merlin主要定位于胞浆（棕色框），而它定位于NRA和扁平底物（红色框）上培养的亚边缘细胞的细胞-细胞接触。样品在8 h去除模板。b条使用平面上的细胞和NRA用AMOT抗体进行Co-IP分析，以研究AMOT和靶蛋白Merlin之间的物理结合，并用Merlin抗体对沉淀进行免疫印迹。c（c）对照组和YAP的裂解液KD（分子量）使用AMOT抗体对细胞进行联合免疫沉淀（co-IP）研究，并用Merlin抗体进行免疫印迹分析。d日控制和梅林KD（分子量）通过下拉试验、YAP表达及其磷酸化对细胞进行免疫印迹以评估Rac1活性。(n个 = 3个生物独立样本* = 对照组与Merlin组活性Rac1与Rac1比值的统计意义KD（分子量）单元格***P（P） < 5 × 10−3).e（电子）Merlin中单个细胞的细胞迁移速度KD（分子量）在含有Rac1抑制剂NSC23766的NRA上培养的细胞片中，上皮细胞片与片边缘距离的函数。（每个独立分析的细胞数量，n个，表示# = 梅林边缘区与最次边缘区速度值的统计意义KD（分子量）细胞，###P（P） < 5 × 10−6. * = 对照组与梅林组的统计显著性KD（分子量）无药物细胞（蓝色）和梅林细胞KD（分子量）有与无药物的细胞（黑色）*P（P） < 0.05和**P（P） < 5 × 10−3).（f）对照和梅林中细胞的扩散KD（分子量）NRA上的上皮片。所有误差条均为S.E.M(n个 = 4个生物独立实验* = 对照组与梅林组细胞播散数的统计学意义KD（分子量）上皮片*P（P） < 0.05).克通过Rac1和Merlin操作的YAP介导的信号级联原理图，控制部分和完全EMT细胞中的细胞速度。所有误差条均为S.E.M，统计显著性由双边学生t吨-测试
图7
图7
NRA调节EMT上激活YAP的双反馈回路。一模拟结果表明，反馈机制导致出现高和低YAP活性的两种稳定状态，表明上皮（低Rac1、高E-cadherin和低YAP）和部分EMT（高Rac1，低E-cadherin和高YAP）状态取决于该系统中的Rac1和E-cadherins活性。b条不同刚度值的NRA上的细胞迁移速度，表明刚度可以调节距板材边缘不同初始距离处YAP激活的基本速率（所有误差条均为S.E.M，每个独立分析的细胞数，n个，表示* = 刚性为10的NRA上细胞速度的统计意义 MPa与1 平均绩点*P（P） < 5 × 10−2, **P（P） < 1 × 10−2、和***P（P） < 5 × 10−3，都是双面学生的t吨-测试）。c（c）模拟YAP活性的双峰分布，作为不同刚度值的NRA子层上距板材边缘距离的函数。d日NRA培养细胞细胞核中刚性依赖性YAP定位。YAP的免疫荧光染色显示，在不同硬度值的NRA上，核定位在距板材边缘不同距离处（顶部）。显示不同YAP染色强度的细胞核分数是与具有不同硬度（底部）的NRA上板材边缘距离的函数（详见补充讨论和补充图17）。样品在6天后固定 h去除模板并诱导上皮扩张。e（电子）YAP介导的地形诱导机械输入对EMT调节的示意图描述，显示了FLP前部暴露于无细胞区域的边缘细胞中的完整EMT，广泛边缘区域中的部分EMT，以及距离边缘最远区域中的上皮组织（无EMT）
图8
图8
拟议机制在肾癌中的潜在作用。一肾癌ACHN信号的差异与EMT、细胞-细胞粘附、播散细胞之间的细胞迁移以及机械信号诱导播散后留在单层内的细胞有关。b条肾透明细胞癌（TCGA，暂定）的序列肿瘤（451个样本）患者数据分析cbio门户肿瘤指纹显示一组肾透明细胞癌中YAP1和WT1的改变。Z-mRNA表达（RNA Seq V2RSEM）和蛋白质表达得分为2.326，机密性为99%（单尾）。c（c）上调YAP1（左）和YAP1/WT1（右）的无病生存率Kaplan–Meier估计（详见“方法”部分）
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