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.2019年6月25日；27（13）：3844-3859.e6。
doi:10.1016/j.celrep.2019.05.087。

小胶质细胞对脊髓背角突触可塑性和慢性疼痛必不可少

周立军 1, 彭季云 2, 徐亚南 三, 曾伟杰 三, 张军 三, 肖伟 三, 春林麦 三, 郑佳琳 三, 刘勇（音） 2, 马杜维卡·穆鲁根 2, Ukpong B Eyo公司 2, 安东尼·德·翁皮埃尔 4, 文俊新 5, 陈涛（Tao Chen） 6, 李明涛 7, Hui Wang（王慧） 8, 杰森·R·理查德森 9, 治滩 10, 刘显国 11, 吴龙俊 12
附属公司

小胶质细胞对脊髓背角突触可塑性和慢性疼痛必不可少

周立军等。 单元格代表. .

摘要

C纤维突触的脊髓长时程增强（LTP）被认为是慢性疼痛的基础。然而，脊髓LTP和慢性疼痛之间的因果关系仍然缺乏。在这里，我们报告了对小鼠坐骨神经的高频刺激（HFS；100 Hz，10 V）可以可靠地诱导脊髓LTP，而不会造成神经损伤。LTP诱导的刺激引发持续35天以上的慢性疼痛，并增加脊髓背角降钙素基因相关肽（CGRP）末端的数量。通过阻断NMDA受体、消融脊髓小胶质细胞或有条件地删除小胶质脑源性神经营养因子（BDNF），可以防止行为和形态的改变。抗集落刺激因子1（CSF-1）抗体抑制HFS诱导的脊髓LTP、小胶质细胞激活和BDNF上调。总之，我们的结果表明，小胶质细胞CSF1和BDNF信号对脊髓LTP和慢性疼痛是不可或缺的。小胶质细胞依赖性突触增强向疼痛通路结构改变的转变可能是疼痛慢性化的基础。

关键词：脑源性神经营养因子；降钙素基因相关肽；慢性疼痛；集落刺激因子1；高频刺激；长期增强；小胶质细胞。

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数字

图1。
图1.不损伤受刺激坐骨神经的HFS在小鼠中诱导脊髓LTP和慢性疼痛超敏反应。
(A类)HFS在10V和20V时可诱导C-纤维突触的脊髓LTP，但在1V时不诱导。在不同强度的坐骨神经高频刺激（HFS）前（i）和后3 h（ii）分别记录C纤维诱发fEPSP的代表性轨迹。利用WinLTP参数提取软件自动测定C纤维诱发fEPSP（红色垂直线）的振幅。比例尺：x=100 ms，y=0.2 mV。C纤维响应的汇总数据表示为绘制的平均值±SEM与。时间如下所示（n=6只小鼠/组）。箭头指示交付HFS的时间点。(B、 C类)有代表性的图像和总结数据显示，HFS后7天，不同强度的L4 DRG神经元和幸存神经损伤（SNI）后7天ATF3的表达。比例尺，100μm。n=3-4只小鼠/组，3片/只小鼠***P（P）<0.001，与假手术组相比，###P（P）< 0.001与。20V HFS，使用Tukey测试进行单向方差分析。(D类)显示了不同强度或SNI的HFS后7天不同组的旋转试验中的下降潜伏期。n=每组5-12只小鼠***P（P）<0.001，与假手术组相比，Tukey检验的单因素方差分析。(E类)HFS或SNI后7天，不同组受刺激坐骨神经中Iba1（常驻巨噬细胞标记物）和NIMP-R14（中性粒细胞标记物）的免疫荧光显示（n=3只小鼠/组，2-3节/只小鼠）。比例尺：50μm。（F）)坐骨神经中Iba1表达的量化***P（P）<0.001，与假手术组相比，###P（P）< 0.001与。20V HFS，使用Tukey测试进行单向方差分析。(G、 H（H）)HFS在10V和20V时显著降低了50%的爪子拔出阈值（PWT，克)von Frey纤丝和爪子回缩潜伏期（PWL，H（H）)辐射热刺激，与假手术组或1V HFS组相比（10V HFS的n=12只小鼠，其他组的n=5-6只小鼠**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。假手术组，采用Fisher LSD测试进行双向方差分析）。(我)在HFS发生前15分钟，在受刺激的坐骨神经上局部应用2%利多卡因（50μl），可防止10V HFS引起的机械阈值降低（n=5-7只小鼠/组）。###P（P）< 0.001与。HFS组，采用Fisher LSD检验进行双向方差分析。(J型)在HFS前30分钟鞘内注射NMDA受体拮抗剂D-AP5（50μg/ml，5μl），但不注射溶媒（Vehi，PBS），可消除HFS诱导的机械性超敏反应（n=6-8只小鼠/组）。##P（P）< 0.01,###P（P）< 0.001与。车辆组，采用Fisher LSD测试进行双向方差分析。
图2。
图2 HFS诱导长时突触增强，并以NMDA受体依赖的方式增强SDH中的CGRP终端。
(A类)fEPSP的原始代表性痕迹和输入/输出曲线（刺激强度/C纤维反应）表明，10 V HFS后3-5小时或7-14天突触效能增强（假手术组和HFS 3-5小时组的n=12只小鼠，HFS 7-14天组的n=8只小鼠，Tukey检验的双向方差分析）。比例尺：x=50 ms，y=0.2 mV(B类)Western blot分析显示了10V HFS后同侧SDH CGRP水平变化的时间进程（n=3-4只小鼠/组）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。假手术组，Fisher LSD测试单因素方差分析。(C类)同侧SDH的典型共焦图像（左）和放大图像（右）显示了CGRP的分布+10V HFS或假手术后7天终止。SDH的薄层用白线显示。较大图像中虚线框区域的代表性较高放大率图像显示CGRP阳性静脉曲张。比例尺：100μm（左）、20μm（右）、5μm（右侧插入）。(D类)直方图显示CGRP的表达增加+HFS后3天或7天，同侧SDH不同层的终末（n=3-4只/组，2-3节/只）**P（P）< 0.01, ***P（P）与假手术组相比<0.001，采用Fisher LSD测试进行单因素方差分析。(E类-F类)电子显微镜和直方图显示假手术组（n=2只小鼠，2-3张显微照片/椎板/小鼠）和HFS组（n=3只小鼠、2-3张显微图片/椎板-小鼠）同侧SDH不同椎板中CGRP免疫活性的静脉曲张和突触。黑色圆圈表示CGRP+静脉曲张和白色箭头CGRP+从突触前膜指向突触后膜的突触。比例尺：200 nm*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与假手术组相比<0.001，采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。(G、 H（H）)双荧光图像和散点图显示，无论是否使用NMDA拮抗剂D-AP5（AP5），10V HFS后7天SDH中CGRP和IB4的表达。比例尺：50μm（左）。n=3只小鼠/组，n=3-4张图像/只小鼠***P（P）与假手术组相比<0.001，###P（P）< 0.001与。车辆HFS组，单因素方差分析与Tukey的事后检验。
图3。
图3小胶质细胞消融阻断HFS诱导的脊髓LTP、CGRP终末增加和机械性超敏反应。
（A）Western blot显示10V HFS后Iba1表达水平的时间进程（n=3只小鼠/组）***P（P）< 0.001与。假手术组，Fisher LSD测试单因素方差分析。(B、 C类)Iba1免疫染色的代表性图像和直方图显示Iba1的数量+10V HFS后1、3、7天和SNI后7天，同侧SDH小胶质细胞增多。伊巴1+HFS后7天（7dI和7dC），细胞仅在同侧增加，而在对侧SDH中没有增加。比例尺：50μm。n=3只小鼠/组，2-3节/只小鼠***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001与。假手术组，###P（P）< 0.001与。HFS 7d组，Fisher LSD测试单因素方差分析。(D类)CX3CR1中白喉毒素治疗后3或21天的对照或小胶质细胞消融（MG-abl）实验设计CreER公司/+：R26iDTR公司/+老鼠。DT：白喉毒素，TM:他莫昔芬，Pain-Beha：疼痛行为测试，EP：电生理学。在DT 3d HFS或DT 21d HFS组中，DT在TM后3周注射，HFS在最后一次使用DT后3或21天分娩。在对照组中，注射TM后注射溶媒（Vehi），但不注射DT。(E类)免疫荧光染色显示，小胶质细胞在DT治疗（DT 3d）后第3天大量耗竭，然后在DT处理（DT 21d）后21天内在CX3CR1中完全重新填充CreER公司/+：R26iDTR公司/+老鼠。方框区域在右侧面板中放大。比例尺：100μm（左）和25μm（右）。(F类)HFS能够在注射DT后21天诱导LTP，但在注射DT后3天不能诱导LTP（DT 3 d组n=12只小鼠，其他组n=6-7只小鼠，Tukey检验的双向方差分析）。上文显示了10V HFS之前（i，灰线）和之后3 h诱发C纤维fEPSP的代表性痕迹（ii，彩色线）。比例尺：x=100 ms，y=0.15 mV。箭头指示HFS交付的时间点。(克)显示了用DT（用于小胶质细胞消融）和载体治疗小鼠HFS后7 d测得的fEPSP的输入-输出曲线（假手术组5只小鼠，MG消融组5只或7只小鼠）。(H、 我)CGRP的增加+HFS诱导的终末在小胶质细胞消融小鼠中显著减弱（n=3只/组，2-3节/小鼠）。比例尺：20μm***P（P）< 0.001与。对照组；#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01与。对照HFS 3d或7d组，采用Fisher LSD测试进行单因素方差分析。(J型)HFS在小胶质细胞完全再生小鼠（DT 21d）中诱导了机械性超敏反应，但在小胶质瘤消融小鼠（DT3d）中未诱导。MG消融DT 3d组n=12只小鼠，其他组n=8只小鼠**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。对照HFS，采用Fisher LSD测试进行双向方差分析。
图4。
图4.小胶质细胞BDNF的消融阻止了LTP诱导、CGRP终末的增加和HFS诱导的机械性异常性疼痛。
(A类)BDNF实验示意图−/−、CX3CR1CreER公司/+：BDNFflox/flox公司小鼠，其中BDNF可以通过TM注射从小胶质细胞中特异性删除。(B类)10V HFS诱导BDNF脊髓LTP+/+小胶质细胞BDNF缺失小鼠（BDNF）−/−). n=6-7只小鼠/组。C纤维场电位示例如上文所示（i，灰线）和10V HFS后3 h（ii，彩色线）。比例尺：x=100 ms，y=0.2 mV。箭头指示发出条件刺激的时间点。(C、 天)典型图像和总结数据表明，HFS诱导的CGRP上调被小胶质细胞BDNF消融抑制（n=3-4只小鼠/组，3-4节/小鼠）***P（P）<0.001 vs BDNF+/+假手术组，###P（P）< 0.001与。BDNF公司+/+HFS组，采用Fisher LSD测试进行单因素方差分析。比例尺：100μm（顶部），20μm（底部）。(E类)与SNI模型不同，与对照组小鼠相比，缺乏小胶质细胞BDNF的雄性和雌性小鼠HFS诱导的机械性痛觉超敏反应显著逆转***P（P）< 0.001与。雌性BDNF+/+HFS或SNI组，采用Fisher LSD测试进行双向方差分析。
图5。
图5 HFS上调CGRP末端的CSF1和小胶质细胞的CSF1受体，导致脊髓LTP和疼痛超敏反应。
(A类,B类)典型图像和统计分析显示，HFS后1～7天和SNI后7天，CSF1在同侧L4 DRG中的表达。三重染色图像显示CSF1、CGRP和ATF3的共定位。箭头表示受损的DRG神经元（ATF3+)强表达CSF1的不表达CGRP。箭头表示未受损的神经元（ATF3−)在HFS或SNI后弱表达CSF1表达CGRP。比例尺：50μm。n=3只小鼠/组，n=2-3张图像/只小鼠*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001与假手术组；###P（P）<0.001，与HFS 7d组相比，采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。(C类)三重染色显示，HFS后3天SDH中CSF1与CGRP共定位，而与IB4共定位。比例尺：20μm。(D类)不同组（n=7-12只小鼠/组）同侧L4-5背根神经节CSF1 mRNA的qRT-PCR分析。数值表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，****P<0.00001 vs.假手术组；###P（P）<0.001，与HFS 7d组相比，采用Fisher LSD检验进行单因素方差分析。(E类)Western blot和统计分析表明，用40 mM KCl处理培养的DRG神经元24 h后，培养液中的CSF1增加。n=6个样品/组**P（P）<0.01 vs Vehi组，未配对学生t吨-测试。(F类,克)免疫染色显示，HFS后1天和3天，同侧背角小胶质细胞中的CSF1R上调（n=3只/组，2-3节/只）。比例尺：50μm***与假手术组相比，P<0.001，###P（P）<0.001，与HFS 7d相比，采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。(H（H）)Western blot显示10V HFS后3天CSF1R和Iba1蛋白水平增加，在HFS前30分钟鞘内注射CSF1中和抗体（抗CSF1，40 ng/μl，5μl）阻止了这种变化（n=3-4只小鼠/组）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。假手术组。###P（P）< 0.001与。对照组采用Fisher LSD检验进行单因素方差分析。(我)在HFS前30分钟的记录段，在脊髓背表面局部应用抗CSF1（40 ng/mμl，20μl）不会影响C纤维反应的基线，但会阻断脊髓LTP的晚期（n=5-6只小鼠/组）。顶部显示了在基线（i）、HFS前30分钟（ii）和HFS后3小时（iii）记录的不同组的C纤维fEPSP的原始痕迹。比例尺：x=100 ms，y=0.2 mV。箭头指示发出条件刺激的时间点。(J型)HFS前30分钟鞘内注射抗CSF1抗体可防止机械性超敏反应的发生（n=6只小鼠/组***P（P）< 0.001与。车辆组（Vehi），采用Fisher LSD测试进行双向方差分析。
图6。
图6 CSF1诱导的CGRP终末增加和疼痛超敏反应需要小胶质细胞BDNF。
（A）HFS上调SDH中BDNF和CGRP的水平，在HFS前30分钟鞘内注射抗CSF1（40.0 ng/μl）可阻止这种作用（n=3-6只小鼠/组）***P（P）< 0.001与。对照组为假手术组。##P（P）< 0.01;###P（P）< 0.001与。对照组；$P（P）<0.05与。抗CSF1假手术组，Fisher LSD试验单因素方差分析。(B至D)在培养的脊髓切片中，CSF1（1μg/ml）显著上调小胶质细胞标记物（CD11b和Iba1）和CSF1R，并且在CSF1前1小时应用p38 MAPK抑制剂SB203580（10μM）可以剂量依赖性地抑制这种效应。比例尺：100μm。n=4-5个样本/组*P（P）< 0.05, ***P（P）与对照组相比，<0.001；###P（P）<0.001 vs CSF1组，采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。(E-F公司)在培养脊髓切片中，用CSF1治疗6小时后上调了CSF1R、磷酸化p38 MAPK(第页-p38）和BDNF，以及培养基中BDNF增加。p38抑制剂SB203580（10μM）预处理可消除CSF1的作用。n=3-5个样本/组**P（P）< 0.01, ***P（P）与对照组相比<0.001；##P（P）与CSF1组相比<0.01，采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。(克)鞘内CSF1上调BDNF中CGRP的表达+/+小胶质细胞BDNF（BDNF）缺乏的小鼠−/−)注射后3天测量（n=3–6只小鼠/组）***P（P）< 0.001与。BDNF公司+/+PBS组，###P（P）< 0.001与。BDNF公司+/+CSF1组，采用Fisher LSD测试进行单因素方差分析。(H（H）)与对照组小鼠（n=5-6只/组，###P（P）< 0.001与。BDNF公司+/+CSF1组），采用Fisher LSD测试进行双向方差分析。
图7。
图7：描述坐骨神经HFS诱发慢性疼痛而无刺激坐骨神经损伤机制的示意图。
坐骨神经HFS（1）使DRG神经元去极化（2），从中枢终末释放CSF1（3）；CSF1激活小胶质细胞CSF1R/p38 MAPK释放BDNF（4）；BDNF通过TrkB/CREB信号传导导致CGRP末端增加（5）小胶质细胞激活和CGRP末端的增加是LTP延长和慢性疼痛的基础（6）。
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