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.2019年6月26日；14（6）：e0218329。
doi:10.1371/journal.pone.0218329。 2019年eCollection。

SIRT1缺陷影响细胞膜损伤后的膜重封

藤原大辅 1, 岩原直司 1 2, Rio Sebori公司 1, 细田良介 1, 顺下山 2, Atsushi Kuno公司 1, Yoshiyuki Horio公司 1
附属公司

SIRT1缺陷影响细胞膜损伤后的膜重封

藤原大辅等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

SIRT1是一种NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，激活它可以改善δ-肌聚糖缺乏TO-2仓鼠和肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠的肌肉病理生理学。我们发现SIRT1在肌肉细胞的细胞膜下高度表达。为了阐明SIRT1对肌肉的功能作用，我们构建了骨骼肌特异性SIRT1基因敲除小鼠（SIRT1-MKO）。与野生型（WT）小鼠相比，SIRT1-MKO小鼠表现出与轻度肌营养不良相似的肌肉病理学，中央有核小肌纤维数量增加，中型（2000-3001μm2）肌纤维数量减少。因此，与WT小鼠相比，SIRT1-MKO小鼠在跑步机和倒挂试验中的运动能力显著降低，血清肌酸激酶活性水平更高。运动后SIRT1-MKO小鼠的肌肉对Evans蓝色染料的摄取量大于WT小鼠，表明SIRT1-M KO小鼠存在膜脆性。由于SIRT1主要定位于肌细胞膜下，SIRT1可能在膜中发挥新的作用。我们发现，与对照细胞相比，SIRT1抑制剂或SIRT1-siRNA显著增加了激光诱导C2C12细胞膜破裂后荧光FM1-43染料的摄入水平。抑制SIRT1或SIRT1敲除会严重干扰损伤部位下膜泡的动态聚集，但不会影响膜修复蛋白的表达水平。这些数据表明，SIRT1在膜破裂肌肉细胞的重新密封中起着关键作用，这可能会影响SIRT1-MKO小鼠的表型。据我们所知，本报告首次证明SIRT1影响质膜修复机制。

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数字

图1
图1。SIRT1-MKO小鼠有轻度营养不良病理。
（a） 6个月龄WT小鼠肌肉切片中SIRT1（ab110304，Abcam）、肌营养不良蛋白、小窝蛋白3和nNOS的免疫荧光染色。骨骼肌细胞质用阴茎倍体蛋白染色。（b） WT小鼠股四头肌细胞质部分和膜部分的免疫印迹。（c） 的级别Sirt1（信号1）采用qPCR方法对12个月龄WT和SIRT1-MKO小鼠股四头肌中含有外显子3和外显子4的mRNA进行分析，引物扩增该区域（n=3）。（d） WT和SIRT1-MKO股四头肌的免疫印迹。WT SIRT1的条带在110kDa左右被检测到，而突变体SIRT1的条带，其缺陷来源于Sirt1（信号1）基因外显子4位于100kDa。α-微管蛋白免疫印迹用作负荷对照。（e） 12个月大时WT（顶部）和SIRT1-MKO（底部）小鼠股四头肌的苏木精和伊红（HE）染色。箭头表示中央有核肌纤维。（f） WT和SIRT1-MKO小鼠股四头肌中央有核肌纤维的频率（两者n=3）。（g） WT和SIRT1-MKO小鼠股四头肌中肌纤维的横截面积（两者n=3）。（h） 12月龄WT（顶部）和SIRT1-MKO（底部）小鼠股四头肌的Masson三色（MT）染色。（i） WT和SIRT1-MKO小鼠的纤维化面积比率（两者n=3）。（j） 使用12个月大的WT（顶部）和SIRT1-MKO（底部）小鼠的股四头肌进行CD31（绿色）免疫荧光染色，显示血管。WGA凝集素染色（红色）用于骨骼肌结缔组织的可视化。（k） 用抗CD31抗体染色的毛细血管数量在WT和SIRT1-MKO小鼠之间相等。图像的比例尺分别为50μm（a，e，h right和j）和200μm（h left）。数据表示为平均值±SEM。显著差异由双尾学生的t吨-测试：*p<0.05，**p<0.001。不另作说明，不重要。
图2
图2。SIRT1-MKO小鼠肌肉脆弱，运动耐力和力量降低。
（a，b）WT和SIRT1-MKO小鼠在3个月龄（a:n=12）和30个月龄时（b:n=6）的跑步机活动。（c） 12个月大的WT和SIRT1-MKO小鼠在跑步机运动后的悬挂时间（n=6）。（d） WT和SIRT1-MKO小鼠在5个月大时的抓握能力（n=5）。（e） 埃文斯蓝染料（EB）吸收实验方案。（f） 跑步机运动1小时后，WT（左）和SIRT1-MKO（右）小鼠股四头肌肌纤维吸收EB（红色）的典型图像。比例尺为500μm。（g） WT和SIRT1-MKO小鼠的EB阳性区域（n=4）。（h） WT和SIRT1-MKO小鼠EB阳性纤维的百分比（n=4）。（i） WT和SIRT1-MKO小鼠在跑步机实验前后的血清肌酸激酶活性（CK）。（k） WT和SIRT1-MKO小鼠在跑步机实验前后的血清乳酸脱氢酶活性（LDH）。（j和l）平板实验前后CK（j:ΔCK）和LDH（l:ΔLDH）活性的差异（WT和SIRT1-MKO小鼠分别为11和8只）。数据表示为平均值±SEM，（a）-（d）、（g）、（h）、（j）和（l）中的显著差异由双尾学生的t吨-测试*p<0.05。进行双向重复测量方差分析和Student-Newman-Keuls事后检验，以确定（i）和（k）中的显著差异。
图3
图3。SIRT1抑制和SIRT1敲除抑制C2C12细胞的膜重封。
（a） 用不同浓度的烟酰胺（NAM）处理12 h后C2C12细胞中乙酰化组蛋白H3（顶部）和总组蛋白H4（底部）的免疫印迹。（b） 通过膜不可渗透的FM1-43染料流入测量的激光损伤后的质膜修复动力学（绿色）。对照组（顶部）和NAM处理的C2C12细胞激光损伤前后的典型图像。X标记（红色）表示激光损伤点，虚线（白色）表示细胞形状。（c） 在用PBS或NAM处理的C2C12细胞中，激光损伤后FM1-43染料流入的时间过程（n＝6）。箭头表示膜损伤的时间点。（d） 激光损伤后5分钟的细胞放大图像。点曲线分别表示激光照射5分钟后的凸面（对照）和凹面（NAM）膜。（e） 激光损伤前后C2C12细胞的典型高倍视野图像。（f） 照射后损伤部位的膜运动。经PBS或NAM处理的C2C12细胞在激光损伤后4分钟的膜位置（n=8）。（g，h）拆除Sirt1 mRNA水平（g，n=3）和SIRT1蛋白水平（h）下降Sirt1-siRNA(Sirt1-si公司). （i） 激光损伤C2C12细胞前后的典型图像Cont-si公司和Sirt1-si公司（j）激光损伤C2C12细胞后FM1-43染料内流随时间的变化Cont-si公司或Sirt1（信号1）-硅（n=8）。箭头表示膜损伤的时间点。（k） 激光损伤5分钟后细胞的放大图像。虚线表示凸面(Cont-si公司)和凹面(Sirt1-si公司)激光照射5min后，取膜。（l） 经处理的C2C12细胞典型高倍视野图像续和Sirt1-si公司.（m）激光损伤后4分钟，用Cont-si公司和Sirt1-si公司（n=8）。用NAM（n）或Sirt1-si公司（o） 与对照细胞比较（n=3）。（p） C2C12成肌细胞和肌管的形态学。（q） C2C12成肌细胞和分化肌管的免疫印迹。（r） 对照组（上图）和NAM治疗的肌管激光损伤前后的典型图像（下图）。（s） 对照组和NAM处理的肌管中激光损伤后FM1-43染料流入的时间过程（n=4）。比例尺分别为20μm（b和i）、5μm（d、e、k和l）和100μm（r）。数据用平均数±SEM表示。显著差异由双尾学生的t吨-测试*p<0.05，**p<0.001。
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这项研究得到了日本科学促进会（JSPS）KAKENHI拨款的部分支持(https://kaken.nii.ac.jp/ja/index网站/)编号15K08312（YH）、17K08600（AK）、17K15582（RH）、18K06965（YH(http://www.nibb.ac.jp/abis/accountements网站); 以及大阪基础医学研究促进基金会藤井裕久纪念馆（Setsuro Fujii Memorial）的拨款(https://www.weblio.jp/content/%E4%B8%80%E8%88%AC%E8%B2%A1%E5%9B%A3%E6%B3%95%E4%BA%E8%7%A4%E4%BA%95%E7%AF%80%E9%83%8E%E8%A8%98%E5%BF%B5%E5%A4%A7%E9%98%AA%E5%9F%BA%E7%8E5%8C%BB%E5%AD%A6%E7%A0%94%E7%A9%B6%E5%A5%A8%E5%8A%B1%E4%BC%9A)大阪难治性疾病医学研究基金会(网址：http://www.nanbyo.or.jp/)，日本临床药理学研究基金会（AK）(https://www.rinyaku-fdn.or.jp/)和MSD生命科学基金会、公共利益公司基金会（AK，NI）(https://www.msd-lifecience-foundation.or.jp/en/). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。