Catalyst-free Click PEGylation reveals substantial mitochondrial ATP synthase sub-unit alpha oxidation before and after fertilisation

doi:10.1016/j.redox.2019.101258

.2019年9月：26:101258。

doi:10.1016/j.redox.2019.101258。 Epub 2019年6月18日。

无催化剂点击聚乙二醇化揭示了受精前后线粒体ATP合成酶亚单位α的大量氧化

詹姆斯·科布利¹, 安娜·诺布尔², 爱德华多·吉梅内斯·费尔南德斯³, 曼纽尔·托马斯·瓦尔迪维娅·莫亚³, 马修·居尔², 霍尔格·胡西³

附属公司

¹自由基研究小组，高地和岛屿大学，健康科学中心，英弗内斯，IV2 3JH，英国。电子地址：james.cobley@uhi.ac.uk。
²朴茨茅斯大学生物科学学院欧洲爪蟾资源中心，英国朴次茅斯国王亨利大厦，PO1 2DY。
³自由基研究小组，高地和岛屿大学，健康科学中心，因弗内斯，IV2 3JH，英国。

PMID： 31234016
预防性维修识别码： PMC6597785型
内政部： 2016年10月10日/j.redox.2019.01258

无催化剂点击聚乙二醇化显示受精前后线粒体ATP合酶亚单位α氧化显著

詹姆斯·科布利等。氧化还原生物. 2019年9月.

.2019年9月：26:101258。

doi:10.1016/j.redox.2019.101258。 Epub 2019年6月18日。

作者

詹姆斯·科布利¹, 安娜·诺布尔², 爱德华多·吉梅内斯·费尔南德斯³, 曼纽尔·托马斯·瓦尔迪维娅·莫亚³, 马修·居尔², 霍尔格·胡西³

附属公司

¹自由基研究小组，高地和岛屿大学，健康科学中心，英弗内斯，IV2 3JH，英国。电子地址：james.cobley@uhi.ac.uk。
²朴茨茅斯大学生物科学学院欧洲爪蟾资源中心，英国朴次茅斯国王亨利大厦，PO1 2DY。
³自由基研究小组，高地和岛屿大学，健康科学中心，因弗内斯，IV2 3JH，英国。

PMID： 31234016
预防性维修识别码： PMC6597785型
内政部： 2016年10月10日/j.redox.2019.01258

摘要

使用非还原性Western印迹法评估蛋白质硫醇氧化还原状态具有挑战性，因为大多数还原和氧化形式在相同的分子量下迁移，因此无法区分。虽然铜催化的Click化学可用于连接聚乙二醇（PEG）部分，称为Click-PEG化，以根据需要质量转移还原或氧化形式，但铜催化的自氧化的可能性存在问题。在这里，我们定义了一种无催化剂反式环辛烯-甲基四嗪（TCO-Tz）逆电子需求Diels-Alder化学方法，该方法可提供快速（k~2000 M）^-1秒^-1)选择性和生物-有机点击聚乙二醇化。我们使用TCO-Tz Click PEGylation研究施肥如何影响可逆线粒体ATP合成酶F₁-F类_o（o）亚单位α（ATP-α-F₁)氧化——非洲爪蟾中受损酶活性的分子相关性。TCO-Tz Click聚乙二醇化研究揭示了大量（约65%）可逆的ATP-α-F₁进化保守半胱氨酸残基（即C²⁴⁴和C²⁹⁴)施肥前后。然而，由于在催化循环期间溶剂暴露量较大，单一硫醇优先被氧化。选择性还原实验表明：S-谷氨酰化占所观察到的可逆氧化的约50-60%，使其成为主要的氧化修饰类型。分子间二硫键也可能因其相对稳定性而起作用。实质性可逆ATP-α-F₁受精前后的氧化具有生物学意义，因为这意味着线粒体F含量较低₁-F类_o（o）ATP合成酶活性。无催化剂TCO Tz-Click聚乙二醇化是一种有价值的新工具，可用于询问健康和疾病中的蛋白质硫醇氧化还原状态。

关键词：ATP合成酶；发展；施肥；线粒体；氧化还原信号。

PubMed免责声明

数字

图1
**无催化剂反-环辛烯-甲基四嗪（TCO-Tz）点击聚乙二醇化示意图。**圆圈左侧描述了TCO-Tz点击PEG减少（点击PEG_红色)其中用TCO-3聚乙二醇（PEG）-马来酰亚胺（TCO-PEG3-NEM，TPN）标记还原硫醇的方案；（2） 6-甲基四嗪PEG 5之前 添加kDa（Tz-PEG5）以启动反电子需求Diels-alder反应，从而质量转移还原硫醇。描述了可选的三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）还原步骤，以在用N-乙基马来酰亚胺（NEM）标记之前还原可逆氧化的硫醇。圆圈右侧描述了TCO-Tz Click-PEG氧化_{OX（氧气）})协议，其中（1）还原硫醇用NEM标记；（2）用TCEP还原可逆氧化的硫醇；（3）在贴上TCO-PEG3-NEM（TPN）标签之前；和（4）添加6 Tz-PEG5以启动反电子需求Diels-Alder反应，从而使可逆氧化的硫醇发生质量转移。最右边的插图描述了NEM介导的Michael加成（顶部）、TPN介导的迈克尔加成到还原硫醇（中部）和反电子需求TCO-Tz Diels-Alder反应（底部）。

图2
**半胱氨酸残留*X·莱维斯*ATP-α-F**₁**进化上是保守的**顶部。选定的常见模式生物的系统发生树。中间。ATP-α-F的多序列比对₁源自Clustal Omega（一个开放访问的在线工具：https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo网站/). 底部。氨基酸标记显示黄色的保守半胱氨酸残基。C类²⁹⁴发生在较早的*X·莱维斯*由于一个小的删除（见正文）。C周围的相邻氨基酸²⁴⁴和C²⁹⁴在门中高度保守。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的Web版本。）

图3
**ATP-α-F**₁在施肥前后会发生大量可逆氧化*X·莱维斯*。左侧。Western blot图像显示可逆氧化（即质量偏移5和10 kDa带）相对于减少的ATP-α-F₁（底部带）前后（15和90 min）施肥*X·莱维斯*。对。可逆ATP-α-F百分比₁氧化之前(n个 = 12）以及施肥后(n个 = 12）量化。每个n个 = 一池5个鸡蛋/胚胎。阳性对照指的是二酰胺（50 30 mM min）处理过的样品。单因素方差分析显示时间点之间没有显著差异(*P（P）* = 0.8306).

图4
**反式环辛烯-甲基四嗪（TCO-Tz）Click-PEG还原**_红色**)证实了实质上可逆的ATP-α-F**₁施肥前后*X·莱维斯*。左。Western blot图像显示减少（即质量移动5和10 kDa带）相对于可逆氧化的ATP-α-F₁（底部带）前后（15和90 min）受精*X·莱维斯*。对。ATP-α-F百分比₁之前的减少(n个 = 9）以及施肥后(n个 = 9）英寸*X·莱维斯*量化。每个n个 = 一池5个鸡蛋/胚胎。阳性对照指TCEP（50 30 mM min）处理过的样品。单因素方差分析显示时间点之间没有显著差异(*P（P）* = 0.6366).

图5
**ATP-α-F**₁在受精前后可逆地S-谷氨酰化*X·莱维斯*顶部。描述S-谷氨酰化蛋白质的选定化学还原策略的反应方案。在这个方案中，GRX2使用谷胱甘肽（GSH）衍生的电子来还原S-谷胱甘膦酰化蛋白质。谷胱甘肽还原酶（GR）用于使用NADPH还原氧化谷胱甘苷（GSSG）。左侧。Western blot图像显示S-谷氨酰化（即质量偏移5和10 kDa带）相对于总ATP-α-F₁（底部带）之前和之后（90 min）受精*X·莱维斯*。对。可逆ATP-α-F百分比₁之前的S-谷氨酰化（即PSSG）(n个 = 10）以及施肥后(n个 = 10）英寸*拉埃维斯X.laevis*量化。每个n个 = 一池5个鸡蛋/胚胎。一项独立的非配对Student t检验显示，可逆s-谷氨酰化在不同时间点之间没有统计学上的显著差异(*P（P）* = 0.8901).

图6
**线粒体F的三维分子模型**₁**-F类**_o（o）**状态3a的ATP合成酶来源于**参考文献[65]在里面*Bos金牛*状态3a对应于F的催化旋转状态₁域。半胱氨酸残基以黄色突出显示，C²⁴⁴左侧和C²⁹⁴在每个模型的右侧显示（左侧：曲面；中心：空间填充；右侧：带状）。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的Web版本。）

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

可逆硫醇氧化抑制线粒体ATP合成酶非洲爪蟾卵母细胞。
Cobley J、Noble A、Bessell R、Guille M、Husi H。 Cobley J等人。抗氧化剂（巴塞尔）。2020年3月5日；9(3):215. doi:10.3390/antiox9030215。抗氧化剂（巴塞尔）。2020 PMID：32150908 免费PMC文章。
Click-PEG化-一种流动性转移方法，用于评估候选蛋白质中半胱氨酸的氧化还原状态。
van Leeuwen LAG、Hinchy EC、Murphy议员、Robb EL、Cocheme HM。 van Leeuwen LAG等人。自由基生物医药，2017年7月；108:374-382. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2017.03037。Epub 2017年3月31日。《自由基生物医药》，2017年。 PMID：28366801 免费PMC文章。
线粒体F0-c亚基的硫醇氧化：一种关闭线粒体ATP合成酶抗菌药物靶点的方法。
Nesci S、Ventrella V、Trombetti F、Pirini M、Pagliarani A。 Nesci S等人。医学假设。2014年8月；83(2):160-5. doi:10.1016/j.mehy.2014.05.004。Epub 2014年5月17日。医学假设。2014 PMID：24932580
F-型ATP合成酶的结构和机制。
库尔布兰特·W·。库尔布兰特·W·。 Annu Rev生物化学。2019年6月20日；88:515-549. doi:10.1146/annurev-biochem-013118-110903。Epub 2019年3月22日。 Annu Rev生物化学。2019 PMID：30901262 审查。
F1FO-ATP合成酶的c环：事实和观点。
Nesci S、Trombetti F、Ventrella V、Pagliarani A。 Nesci S等人。《分子生物学杂志》。2016年4月；249(1-2):11-21. doi:10.1007/s00232-015-9860-3。Epub 2015年11月30日。《分子生物学杂志》。2016 PMID：26621635 审查。

查看所有类似文章

引用人

50种不同程度的氧化应激：一种状态特异性半胱氨酸氧化还原模式假说。
科布利JN。科布利JN。氧化还原生物。2023年11月；67:102936. doi:10.1016/j.redox.2023.102936。Epub 2023年10月17日。氧化还原生物。2023 PMID：37875063 免费PMC文章。
化学蛋白质组学策略确定p120-catenin谷胱甘肽酰化调节E-cadherin降解和细胞迁移。
Kukulage DSK、Yapa Abeywardana M、Matarage Don NNJ、Hu RM、Shishikura K、Matthews ML、Ahn YH。 Kukulage DSK等人。细胞化学生物学。2023年12月21日；30（12）：1542-1556.e9。doi:10.1016/j.chembiol.2023.08.004。Epub 2023年9月14日。细胞化学生物学。2023 PMID：37714153
蛋白质谷胱甘肽酰化的新兴化学和生物学。
Kukulage DSK、Matarage Don NNJ、Ahn YH。 Kukulage DSK等人。当前操作化学生物。2022年12月；71:102221. doi:10.1016/j.cbpa.2021002221。Epub 2022年10月9日。当前操作化学生物。2022 PMID：36223700 免费PMC文章。审查。
RedoxiFluor：一种微板技术，以相对百分比和摩尔数量化靶蛋白巯基氧化还原状态。
Tuncay A、Noble A、Guille M、Cobley JN。 Tuncay A等人。《自由基生物医药》，2022年3月；181:118-129. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2022.01.023。Epub 2022年2月4日。《自由基生物医药》2022。 PMID：35131446 免费PMC文章。
辅助生殖中线粒体ROS生成机制：已知、未知和有趣。
科布利JN。科布利JN。抗氧化剂（巴塞尔）。2020年9月29日；9(10):933. doi:10.3390/antiox9100933。抗氧化剂（巴塞尔）。2020 PMID：33003362 免费PMC文章。审查。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Murphy M.P.线粒体如何产生活性氧。生物化学。J.2009年；417:1–13.-项目管理咨询公司-公共医学
1. 品牌M.D.线粒体产生超氧化物和过氧化氢，作为线粒体氧化还原信号的来源。自由基。生物医药2016；100:14–31.-公共医学
1. Collins Y.、Chouchani E.T.、James A.M.、Menger K.E.、Cocheme H.M.、Murphy M.P.线粒体氧化还原信号一览。细胞科学杂志。2012;125:1837.
1. Echtay K.S.、Roussel D.、St-Pierre J.、Jekabsons M.B.、Cadenas S.、Stuart J.A.、Harper J.A.、Roebuck S.J.、Morrison A.、Pickering S.、Clapham J.C.、Brand M.D.超氧化物激活线粒体解偶联蛋白。自然。2002;415:96–99.-公共医学
1. Giorgio M.、Trinei M.、Migliaccio E.、Pelicci P.过氧化氢：代谢副产物还是衰老信号的常见介质？自然修订版分子细胞生物学。2007;8:722–728.-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源
其他文献来源
- 镜片-专利引文

[1] Murphy M.P.线粒体如何产生活性氧。生物化学。J.2009年；417:1–13.-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Murphy M.P.线粒体如何产生活性氧。生物化学。J.2009年；417:1–13.-项目管理咨询公司-公共医学

[3] 品牌M.D.线粒体产生超氧化物和过氧化氢，作为线粒体氧化还原信号的来源。自由基。生物医药2016；100:14–31.-公共医学

[4] 品牌M.D.线粒体产生超氧化物和过氧化氢，作为线粒体氧化还原信号的来源。自由基。生物医药2016；100:14–31.-公共医学

[5] Collins Y.、Chouchani E.T.、James A.M.、Menger K.E.、Cocheme H.M.、Murphy M.P.线粒体氧化还原信号一览。细胞科学杂志。2012;125:1837.

[6] Collins Y.、Chouchani E.T.、James A.M.、Menger K.E.、Cocheme H.M.、Murphy M.P.线粒体氧化还原信号一览。细胞科学杂志。2012;125:1837.

[7] Echtay K.S.、Roussel D.、St-Pierre J.、Jekabsons M.B.、Cadenas S.、Stuart J.A.、Harper J.A.、Roebuck S.J.、Morrison A.、Pickering S.、Clapham J.C.、Brand M.D.超氧化物激活线粒体解偶联蛋白。自然。2002;415:96–99.-公共医学

[8] Echtay K.S.、Roussel D.、St-Pierre J.、Jekabsons M.B.、Cadenas S.、Stuart J.A.、Harper J.A.、Roebuck S.J.、Morrison A.、Pickering S.、Clapham J.C.、Brand M.D.超氧化物激活线粒体解偶联蛋白。自然。2002;415:96–99.-公共医学

[9] Giorgio M.、Trinei M.、Migliaccio E.、Pelicci P.过氧化氢：代谢副产物还是衰老信号的常见介质？自然修订版分子细胞生物学。2007;8:722–728.-公共医学

[10] Giorgio M.、Trinei M.、Migliaccio E.、Pelicci P.过氧化氢：代谢副产物还是衰老信号的常见介质？自然修订版分子细胞生物学。2007;8:722–728.-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

无催化剂点击聚乙二醇化揭示了受精前后线粒体ATP合成酶亚单位α的大量氧化

附属公司

无催化剂点击聚乙二醇化显示受精前后线粒体ATP合酶亚单位α氧化显著

作者

附属公司

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源