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.2019年6月21日；10(1):2735.
doi:10.1038/s41467-019-10676-1。

IL-33介导的肥大细胞活化通过巨噬细胞动员促进胃癌

莫里茨·F·艾斯曼 1, 克里斯汀·迪克斯特拉 1, 安德鲁·贾尼基 2, 托比·菲斯 1 三, 杰米娜·布伦伯格 1 4, 阿什利·波赫 1, 尼玛·埃特马迪 1 5, 伊芙琳·桑提科斯 6, 斯特凡·蒂姆 1, 尼古拉斯·D·亨廷顿 7, 玛格丽特·希布斯 6, 亚历克斯·布西奥塔斯 8, 米歇尔·格林伯德斯顿 9 10, 迈克尔·巴切特 1, 罗伯特·J·奥多诺休 1 2, 弗雷德里克·马森 1 11, 马蒂亚斯·恩斯特 12
附属机构

IL-33介导的肥大细胞活化通过巨噬细胞动员促进胃癌

莫里茨·F·艾斯曼等。 国家公社. .

摘要

肥大细胞在实体恶性肿瘤微环境中的作用仍有争议。在此，我们对小鼠和人类肠道型胃癌中癌旁粘膜下肥大细胞积聚的影响进行了功能评估。我们发现肥大细胞的基因消融或治疗性失活抑制肿瘤相关巨噬细胞的积聚，减少肿瘤细胞增殖和血管生成，并减轻肿瘤负担。肥大细胞被白介素（IL）-33激活，白介素-33是一种由肿瘤上皮细胞产生的警报器蛋白，对小鼠胃癌生长所需的炎性细胞因子IL-11作出反应。因此，消融同源IL-33受体St2可限制肿瘤生长，并减少肥大细胞依赖性的生成和巨噬细胞吸引因子Csf2、Ccl3和Il6的释放。相反，基因或治疗性巨噬细胞耗竭可减少肿瘤负担，而不会影响肥大细胞的丰度。因此，肿瘤衍生的IL-33维持肥大细胞和巨噬细胞依赖的信号级联，有利于胃癌的治疗。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
小鼠和人类胃癌粘膜下肥大细胞数量增加。一100日龄婴儿胃的代表性横截面gp130标准显示基因型的突变小鼠，甲苯胺蓝染色，分别显示受影响的胃窦（AN）和胃窦肿瘤（AT）。肥大细胞呈紫色（箭头）。比例尺 = 50 微米。b条粘膜下肥大细胞的定量(一).n个 = 从两个独立实验中获得的每个队列7只小鼠，单因素方差分析F（DFn = 自由度提名人 = 自由度分母） = 34.96 (3, 24).c（c）人胃癌（GC）及其邻近粘膜下层和正常胃粘膜下层甲苯胺蓝染色活检芯的代表性切片。比例尺 = 50 微米。d日粘膜下肥大细胞的定量c（c）每个符号代表一个患者正常粘膜下层活检（N；n个 = 22）、胃炎（气体；n个 = 2） 肠化生（IM；n个 = 4） ，漫反射（Dif；n个 = 8） ，混合（混合；n个 = 3） 肠型（Int；n个 = 8） 胃癌。单向方差分析F（DFn，Dfd） = 5.809 (5, 41). 数据表示为平均值 ± SEM，带第页 < 0.05视为显著。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图1
图2
图2
肥大细胞缺陷的胃肿瘤负担减轻gp130标准FF公司肿瘤小鼠。一代表性的整群被钉住的胃，从100日龄开始gp130标准FF公司;c-套件+/+和肥大细胞缺陷gp130标准FF公司;c-套件W-sh/W-sh老鼠。比例尺 = 1 毫米。b条每只小鼠总肿瘤负担的量化(一). 每个符号代表一个单独的鼠标。单向方差分析F（DFn，Dfd） = 25.97 (2, 24).c（c）肿瘤总数和肿瘤大小分布的计数，如一从gp130标准FF公司;c-套件+/+(n个 = 14） 和gp130标准FF公司;c-套件W-sh/W-sh老鼠(n个 = 11). 单向方差分析F（DFn，Dfd） = 24.59 (7, 92).d日免疫染色胃癌切片上CD31、缺氧探针（缺氧）、BrdU（增殖）或ApopTag（凋亡）的定量。CD31的小鼠数量（n）：FF；c-套件+/+ n个 = 7、消防；c-套件W-sh/W-sh n个 = 11，方差分析F（DFn，Dfd） = 7.075 (3, 34); 缺氧探头：FF；c-套件+ n个 = 5、消防；c-套件W-sh型 n个 = 6个，带t吨-测试 + 韦尔奇校正t（df） = 2.55 (5.256); BrdU:FF；c-套件+ n个 = 3、消防；c-套件W-sh型 n个 = 4个，带t吨-测试t（df） = 4.905 (5); 细胞凋亡：FF；c-套件+ n个 = 4、消防；c-套件W-sh型 n个 = 6个，带t吨-测试t（df） = 0.89 (8).e（电子）肥大小鼠肿瘤总负荷的量化消防；MC公司重量（基因型：消防；Cpa3-Cre公司否定; Mcl1公司飞行/飞行和FF、Cpa-Cre；麦克尔1+/+)和肥大细胞缺陷消防；MC公司定义（基因型：消防；Cpa3-Cre；Mcl1公司飞行/飞行)老鼠。t吨-测试t（df） = 6.72 (24).（f）每只小鼠的肿瘤数计数消防；MC公司重量(n个 = 17只小鼠）和肥大细胞缺乏消防；MC公司定义(n个 = 9消防；Cpa3-Cre；Mcl1公司飞行/飞行老鼠）。单向方差分析F（DFn，Dfd） = 23.25 (7, 96).克CD31胃血管生成染色定量(e（电子）,（f）).FF；MC公司重量(n个 = 8只小鼠）和消防；MC公司定义(n个 = 5） 带单向方差分析F（DFn，Dfd） = 6.79（3，22）。小时肿瘤总负担的量化gp130标准FF公司给小鼠服用色甘酸（肥大细胞脱颗粒抑制剂）或载体6周后。每个符号代表一只单独的鼠标，数据是在三个独立的实验中生成的。t吨-测试第页显示值和t（df） = 2.313 (18). 数据表示为平均值 ± SEM，带第页值第页 < 0.05，视为显著。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图2
图3
图3
肥大细胞耗竭减少胃肿瘤中巨噬细胞浸润gp130标准FF公司老鼠。一胃癌组织切片中巨噬细胞（F4/80）、B细胞（B220）或T细胞（CD3、CD8、Foxp3）免疫染色的典型组织切片图像gp130型FF公司;c-套件+/+和肥大细胞缺陷gp130标准FF公司;c-套件W-sh/W-sh老鼠。箭头表示特异性阳性细胞染色；比例尺 = 100 微米。b条肿瘤和肿瘤相关粘膜下层切片中F4/80、B220或CD3表达细胞的定量(一). F4/80层：n个 = 每组6个，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 13.43 (3, 20); B220：n个 = 每组6个，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 3.782 (3, 20); CD3：消防；c-套件+/+ n个 = 6,消防；c-套件W-sh/W-sh n个 = 5，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 11.55（3，18）；CD8:FF、c-Kit+/+ n个 = 8,消防；c-套件W-sh/W-sh n个 = 6,t吨-测试t（df） = 0.71 (12); Foxp3:FF、c-Kit+/+ n个 = 6，FF；c-套件W-sh/W-sh n个 = 8,t吨-测试t（df） = 0.33 (12). 对两个独立实验的数据进行了分析。c（c）80层/四层+胃粘膜下层和肿瘤中的细胞频率消防；MC公司重量老鼠(n个 = 9） 和肥大细胞缺陷消防；MC公司定义老鼠(n个 = 7消防；Cpa3-Cre；Mcl1公司飞行/飞行). 单向方差分析F（DFn，Dfd） = 10.81 (3, 28).d日F4/80的量化+所示基因型小鼠粘膜下层或粘膜中未受影响的胃窦（AN）或胃窦肿瘤（AT）中的细胞。所有组n个 = 4.粘膜下：单向方差分析F（DFn，Dfd） = 10.12 (3, 12); 粘膜：单向方差分析F（DFn，Dfd） = 5.086 (3, 12).e（电子）F4/80的量化+来自Tg的小鼠粘膜下层或粘膜中未受影响的胃窦（AN）或胃窦肿瘤（AT）中的细胞(Tff1-CreERT2）;匹克3caH1047R型/+;铂族飞行/飞行拉紧任一港口（Cre+)或缺乏（Cre−)的发送1-CreERT2驱动程序。Cre公司−AN公司n个 = 4,Cre公司+AN和Cre公司+自动变速箱n个 = 两者均为5。来自两个独立实验的分析。粘膜下：单因素方差分析F（DFn，Dfd） = 10.52 (2, 11); 粘膜：单向方差分析F（DFn，Dfd） = 7.485 (2, 11). 数据表示为平均值 ± 扫描电镜，带第页值第页 < 0.05被认为是显著的。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图3
图4
图4
肿瘤负担gp130标准FF公司巨噬细胞耗竭后，小鼠数量减少。一所示基因型100天龄小鼠的代表性全胃。比例尺 = 1 毫米。b条每只小鼠总肿瘤负担的量化(一). 每个符号代表一个单独的鼠标。由于健康不佳，一些人gp130型前/后; Csf1r公司−/−必须在100人之前对小鼠进行分析 日终末点；各组小鼠的平均年龄为：gp130标准前/后; Csf1r公司+/+88.2天，gp130标准前/后; Csf1r公司+/−90.4天，以及gp130标准前/后; Csf1r公司−/−81.6天。单向方差分析F（DFn，Dfd） = 27.55 (2, 27).c（c）对指定基因型的胃窦粘膜下层肥大细胞密度进行量化gp130标准前/后; Csf1r公司+/+ n个 = 9和gp130标准前/后; Csf1r公司−/负极 n个 = 来自两个独立实验的5个生物样本t吨-测试t（df） = 0.262 (12).d日年肿瘤总负荷的评估gp130标准FF公司给药6周后的小鼠（50 μl含5的clodrosome溶液 mg/ml氯膦酸盐）或溶媒。每个符号代表一个单独的鼠标；来自两个独立实验的数据(t吨-测试t（df） = 2.622 (11)).e（电子）胃肿瘤（T）和肿瘤相关粘膜下层（SM）的F4/80、CD31、ApopTag或甲苯胺蓝（用于检测肥大细胞）染色切片的定量gp130标准FF公司指定治疗队列的小鼠。F4/80：全部n个 = 5，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 27.17 (3, 16); CD31：n个 = 6（SM组织），n个 = 5（T组织），单因素方差分析F（DFn，Dfd） = 18.15 (3, 18); 凋亡细胞：n个 = 4（两组），t吨-测试t（df） = 0.27 (6); 肥大细胞：n个 = 8（车辆）和n个 = 7（氯膦酸盐），t吨-测试t（df） = 0.73 (13). 数据表示为平均值 ± SEM，带第页值第页 < 0.05被认为是显著的。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图4
图5
图5
巨噬细胞靶向性和巨噬细胞极化gp130标准FF公司肿瘤。一总肿瘤负担gp130型FF公司用PLX3397（Csf1r/c-Kit/Flt3酪氨酸激酶受体抑制剂）或载体治疗4周或无治疗随访4周后，对小鼠进行急性定量。每个符号代表一个单独的鼠标。给出了三个独立实验的数据。t吨-测试t（df） = 5.23 (14).b条胃粘膜下层（SM）或胃肿瘤（T）F4/80、CD31、缺氧探针或甲苯胺蓝染色切片的定量gp130标准FF公司指定急性治疗队列的小鼠。F4/80层：n个 = 5（车辆）和n个 = 6（PLX3397），单向方差分析F（DFn，Dfd） = 12.34 (3, 18); CD31：n个 = 6，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 18.33 (3,20); 缺氧组织：n个 = 三，t吨-Welch校正t（df）检验 = 2.53 (2); 肥大细胞：n个 = 8（两组），以及t吨-用韦尔奇修正t（df）进行测试 = 5.59 (9.27).c（c）选择性激活相关基因的qPCR表达分析(Arg1、Fizz1、Mrc1)，经典激活(2个)和血管生成(素食主义者)纯化F4/80+肿瘤相关巨噬细胞（FF-Tum）或刺激来自野生型小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）并用载体（wt-BMDM）或IL-4/IL-13（20 ng/ml）诱导替代激活的内切型（M2 BMDM）。n个 = 3只老鼠。哈希表示表达式低于检测极限。参数1：t吨-测试t（df） = 3.8 (4); 泡沫1：t吨-测试t（df） = 2.39 (4); Mrc1：t吨-测试t（df） = 4.69 (4); 素食主义者：t吨-测试t（df） = 3.96 (4). 数据表示为平均值 ± SEM，带第页值第页 < 0.05被认为是显著的。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图4
图6
图6
IL-33在胃肿瘤中的表达gp130标准FF公司小鼠肥大细胞活化分析。一qPCR表达分析伊利33和全长St2(一级方程式1)造血相关基因（CD45+; EpCam公司−)和上皮细胞（EpCam+; CD45型−)从野生型和gp130标准FF公司（FF）小鼠。数据标准化为Gapdh公司并绘制为CD45的相对表达+; EpCAM公司−WT AN表达式。n个 = 5只小鼠。EpCam中的Il1rl1表达+; CD45型−一些样品的细胞低于检测限。数据来自两个独立的实验。对于IL33数据，使用F（DFn，Dfd）进行单向方差分析 = 2.871(5, 22);b条携带肿瘤的胃中IL-33的免疫荧光染色gp130标准FF公司插入未受影响的胃窦（I）、粘膜下肿瘤交界处（II）、肿瘤核心（III）和肿瘤边缘（IV）的小鼠。胃来自伊利33−/−小鼠用于特异性对照。比例尺 = 200 微米。c（c）用IL-33（30）刺激FACS纯化的肿瘤相关肥大细胞上清液的多重细胞因子分析 ng/ml），适用于3 h.数据仅显示具有>的因子 与未刺激对照培养物相比增加了3倍。n个 = 4来自四个独立的实验。d日用IL-33（30）刺激FACS纯化的肿瘤相关肥大细胞qPCR基因表达分析 ng/ml），适用于3 h或车辆。n个 = 4来自四个独立的实验。Ccl2公司以下为：t吨-测试t（df） = 3.61 (6);Ccl3公司以下为：t吨-测试t（df） = 3.2 (3.09);Ccl7公司以下为：t吨-测试t（df） = 2.84 (6);素食主义者以下为：t吨-测试t（df） = 2.45（6）。e（电子）来自胃窦肿瘤（AT）的器官样体的代表性图像gp130标准FF公司用PBS或IL-11刺激小鼠（100 ng/ml，持续2天）。比例尺 = 200 微米。（f） 伊利33基因表达分析gp130标准FF公司用IL-11（100）刺激肿瘤衍生的上皮类器官 ng/ml）或使用PBS 4 h.对于Stat3-靶基因的比较表达，社会3，也进行了分析。n个 = 5来自两个独立的实验。状态3以下为：t吨-测试t（df） = 4.96 (4.42);社会3以下为：t吨-测试t（df） = 5.6 (4.48). 数据表示为平均值 ± SEM，带第页值第页 < 0.05被认为是显著的。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图5
图7
图7
St2受体缺乏降低肿瘤负担gp130标准FF公司老鼠。一所示基因型100日龄小鼠肿瘤总负荷的量化。每个符号代表一个单独的鼠标。用F（DFn，Dfd）进行单因素方差分析 = 11.83 (2, 48).b条年小鼠肿瘤总数的计数一根据肿瘤大小进行分类。n个 = 12 (FF，标准2+/+),n个 = 20 (FF，标准2+/−)、和n个 = 19 (FF，标准2−/−)老鼠。用F（DFn，Dfd）进行单因素方差分析 = 22.79（1192）。c（c）甲苯胺蓝（用于检测肥大细胞；粘膜下组织）、F4/80和CD31染色的指定基因型小鼠胃肿瘤切片的定量。肥大细胞：n个 = 10只小鼠，t吨-测试t（df） = 4.25 (18); F4/80层：n个 = 8（FF；标准2+/+),n个 = 9（FF；标准2−/−)，单向方差分析F（DFn，Dfd） = 27.52 (3,29); CD31：n个 = 6（粘膜下层）n个 = 5（肿瘤）和单向方差分析F（DFn，Dfd） = 13.6 (3,19).d日FACS纯化的两种人胃肿瘤相关肥大细胞表达趋化因子的qPCR分析FF；标准2+/+或消防；标准2−/−老鼠。全部n个 = 4来自两个独立的实验。Csf2型以下为：t吨-测试t（df） = 3.81 (6);Ccl3公司以下为：t吨-测试t（df） = 3.97 (6);Ccl7公司以下为：t吨-测试t（df） = 0.88(6);伊尔6::t吨-测试t（df） = 4.02 (6);e（电子）,（f）显示基因型的未受影响胃窦（AN）和胃窦肿瘤（AT）ILC2细胞（谱系）频率的流式细胞术分析−，Cd11b−、Gata3+)、Tregs（Foxp3+，CD4+)和St2比例+这些单元格类型中的单元格。FF；标准2+/+ n个 = 7和消防；标准2−/− n个 = 来自两个独立的实验。ST2型+/ILC2：t吨-测试t（df） = 4.39 (12); ST2型+/特雷格：t吨-测试t（df） = 0.98 (12).克14周大时肿瘤总负担的计数消防；标准2−/−宿主小鼠接受尾静脉注射消防；标准2−/−或FF，St2型+/+骨髓源性肥大细胞（BMMC）(n个 = 每组8只小鼠）。与Mann–Whitney一起进行Mann–Whitney测试U型 = 11.5. 数据表示为平均值 ± 扫描电镜，带第页值第页 < 0.05被认为是显著的。源数据作为源数据文件提供。另请参见相关补充图6
图8
图8
IL-33肥大细胞激活基因表达特征的Kaplan-Meier分析。一来自DERRICO胃数据集（GEO:GSE13911，摘自oncomine.org）的IL-33依赖性肥大细胞激活相关基因的表达分析，并比较正常胃粘膜(n个 = 31）和胃肠型腺癌(n个 = 29). 这个第页-基因的价值是第页 < 0.05，除非另有说明。b条–d日对人类肠道型胃癌（iGC）进行Kaplan-Meyer生存分析，IL-33/肥大细胞激活特征包括CCL2级,CCL3级,CCL4类,IL1a级,IL6（IL6）,CSF2型、和CCL7号机组(b条)，具有选择性激活巨噬细胞表达特征(CD163型,CD204型,MARCO公司,ARG1公司) (c（c）)和经典活化巨噬细胞表达特征(NOS2A号,人类白细胞抗原-DRA,CD80型,CD86型,CD169号) (d日).e（电子）拟议胃癌生长促进IL-11/IL-33/肥大细胞/TAM信号轴的示意图。源数据作为源数据文件提供。另见相关补充图7
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