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.2019年6月21日；15（6）：e1007875。
doi:10.1371/journal.ppat.1007875。 eCollection 2019年6月。

水泡性口炎病毒感染细胞中多聚体相关mRNA的全局分析

威廉·奈德迈尔 1, 肖恩·P·J·惠兰 1
附属公司

水泡性口腔炎病毒感染细胞中多聚体相关信使核糖核酸的全局分析

威廉·奈德迈尔等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

水疱性口炎病毒（VSV）感染哺乳动物细胞后，细胞翻译受到抑制，而病毒翻译有效进行。VSV RNA合成完全发生在细胞质内，在转录过程中，病毒聚合酶产生5个mRNA，就其5'帽结构和3'聚腺苷酸尾部而言，这些mRNA在结构上与细胞mRNA不明显。利用对总细胞质、单体和多体相关mRNA进行大规模平行测序的全局方法，我们探讨了HeLa细胞VSV感染对翻译的影响。对不同组分的序列读取分析表明，在感染后6小时内，超过60%的细胞质和多聚体相关读取映射到5个病毒基因，在这个时间点可以观察到强大的宿主细胞翻译关闭。与多聚体组分中大量的病毒mRNA一致，细胞基因的读谱映射减少。感染后保持多聚体相关的细胞mRNAs半衰期更长，通常更大，AU更丰富，这些特征与病毒mRNA相同。其中一些mRNAs编码已知对病毒复制有积极影响的蛋白质，通过化学抑制和siRNA缺失，我们证实由2个这样的mRNAs-编码的宿主伴侣热休克蛋白90（hsp90）和真核翻译起始因子3A（eIF3A）支持病毒复制。相应地，由宿主mRNA编码的发育调控和DNA损伤1（Redd1）具有减少的多聚体关联抑制病毒感染。这些数据强调了病毒mRNA丰度在VSV感染细胞中阻断宿主翻译的重要性，并将一些细胞mRNA的差异翻译性与促病毒或抗病毒功能联系起来。

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数字

图1
图1。感染后6小时，病毒mRNA占细胞质mRNA的60%。
（A） 实验设计示意图。在MOI为10时用VSV感染HeLa细胞，在2和6 hpi时制备细胞质提取物，用于mRNA分离和多聚体分析。信使RNA是从与80S单体或含有3个或更多核糖体的多聚体相对应的组分中分离出来的，并用于深度测序。（B） 未感染（黑色）或VSV（红色）感染HeLa细胞的多聚体分析。通过10–50%蔗糖梯度沉淀细胞质提取物，收集0.5 ml组分，同时在λ=254nm处连续监测吸光度。（C） 在2和6 hpi的细胞质、单体和多体样本中，定位到连接hg38（人类）和VSV基因组的片段分布。在CLC Genomics Workbench中进行修剪和绘图。（D） 在2和6 hpi的5个病毒基因中的读数分布。表达水平表示为每千百万转录物（TPM），以归一化基因长度和库大小，误差条表示两个生物复制的标准偏差。
图2
图2。细胞质和多聚体中单个细胞mRNA的相对丰度在2-6 hpi之间减少。
（A） 外显子区域在2 hpi时每千百万碱基（TPM）转录本的散点图。给定mRNA在未感染细胞中的TPM绘制在横坐标上，未感染细胞（黑色圆圈）或VSV感染细胞（灰色圆圈）中给定细胞mRNA的TPM绘在纵坐标上。病毒信使核糖核酸由红色三角形表示。（B） 原木密度图2未感染或VSV感染细胞在2 hpi时细胞mRNA TPM的倍数变化。C、 M和P分别表示“细胞质”、“单体”和“多体”。（C） 单个mRNA在6 hpi时的TPM散点图，如日志的A.（D）密度图所示2TPM在6 hpi时的折叠变化，如B所示。
图3
图3。VSV感染后细胞mRNA的单体和多体关联的变化。
（A） 密度图显示日志2在2hpi下，任何给定mRNA在单体和多体部分的折叠变化。平均值95%置信区间内的密度区域为灰色阴影。洋红色线表示平均值的±2标准偏差。关联度相对于平均值增加的区域显示为蓝色，关联度减少的区域显示绿色。（B） 在6 hpi下进行分析，如A所示。对绿色或蓝色区域的基因进行下游分析。（C） 原木图2在感染细胞中，2hpi的结合倍数变化与细胞质丰度成反比。洋红色线表示平均对数的±2标准偏差2折叠变化。95%置信区间以外的基因用蓝色（增加）或绿色（减少）圆点表示。（D） 日志2如C.（E）多聚体关联增加的mRNAs的基因本体分析所示，6 hpi时关联的倍数变化，使用R中的GOseq进行分析。所示饼图表示mRNA在20个最重要的GO术语中的分布。（F） 使用GOseq在R中确定的多聚体关联减少的mRNA的基因本体分析。
图4
图4。多聚体相关的细胞mRNA更长，AU更丰富。
（A） 与未感染细胞中细胞质丰度在平均丰度（灰色）2个标准偏差内的mRNA相比，分析细胞质丰量高（紫色）或低（橙色）的细胞mRNA。TPM测定的细胞质丰度来自本文发表的数据集***p<2.2 x 10−16; **p<5.0 x 10−5; *p<0.05；根据Wilcoxon秩和检验，与相对丰度水平在平均值95%置信区间内的mRNA相比，所有其他p>0.05。铰链对应于第25-75百分位，胡须表示四分位间距的1.5倍。（B） 感染细胞的细胞质丰度分析如A所示。如图3所示，在6 hpi时，多聚体结合增加（蓝色）或多聚体联系减少（绿色）的mRNA的（C-F）mRNA特征。RNA半衰期和poly（A）尾巴长度的数据来自[54，55]。按照A进行分析。
图5
图5。抑制特定宿主基因功能对病毒基因表达的影响。
（A） rVSV-eGFP报告病毒在未感染、车用治疗或2.5μM 17-DMAG治疗的HeLa细胞中的GFP表达。右侧显示了GFP强度的代表性直方图，活细胞的平均荧光强度（MFI）如下所示。MFI标准化为车辆，误差条表示与3个独立重复平均值的标准偏差。（B） eIF3a缺失HeLa细胞中VSV基因的表达。荧光强度的代表性直方图显示在右侧，MFI显示在下方。误差条表示与三个独立重复的平均值的标准偏差。由rVSV-LUC（萤火虫荧光素酶）或细胞报告子驱动eIF3a缺失细胞中Renilla荧光素酶（pRL-CMV）表达的荧光素素酶表达。荧光素酶表达以非靶向siRNA对照的百分比表示，误差条表示与3个独立复制的标准偏差。感染野生型VSV的eIF3a缺失HeLa细胞的代谢标记。病毒蛋白的位置标注在右侧。呈现的是来自两个独立复制品的代表性凝胶。（C） DDIT4缺失细胞中VSV基因的表达和复制。eGFP表达的代表性直方图与归一化为非靶向siRNA对照的细胞MFI一起显示。误差线表示与三个独立重复平均值的标准偏差。对于代谢标记，提出了两个独立重复的代表性凝胶。通过滴定siRNA处理的HeLa细胞感染后不同时间的产量来测量病毒复制动力学。误差线表示与3个独立重复平均值的标准偏差。（D） VSV感染后合成的细胞蛋白的免疫沉淀重量所示为来自两个独立复制品的代表性凝胶。HSP70和YBX1波段的定量分析显示在底部的两个面板中，误差条表示两个独立重复的标准偏差。
图6
图6。感染后多聚体内细胞mRNA分布改变。
（A） 由RNAseq确定的6 hpi时细胞mRNA的单体或多体关联。通过多聚体分析和qPCR挑选用于验证的基因以橙色突出显示。（B-E）未感染或感染的HeLa细胞在6 hpi时多聚体中mRNA的分布。6 hpi时感染细胞的典型多聚体痕迹以浅灰色显示，未感染细胞中的mRNA多聚体分布以黑色显示，感染细胞以红色显示。RNA分布以总回收率的分数表示。误差条表示三个独立重复的标准偏差。（B） VSV N和G mRNA的分布。（D） 感染后多聚体结合不变的RNA。（E） 多糖体结合减少的mRNA。
图7
图7。cap甲基化缺陷病毒突变体的转录物在感染细胞中有效翻译。
（A） VSV N和G mRNA在6 hpi与野生型VSV的多聚体分布。每个单个多聚体部分的qPCR结果以回收总量的一部分的形式显示，用红色表示。误差条表示两个独立重复的标准偏差，感染细胞的代表性多聚体图谱用灰色表示。（B） VSV N和G mRNAs在6 hpi处的多聚体分布，VSV突变缺乏鸟嘌呤N-7帽甲基化，LG1670A型（C）VSV N和G mRNA在6 hpi处的多聚体分布，VSV突变株LG4A公司鸟嘌呤-N-7和核糖-2′-O帽甲基化缺陷。（D） Western blot显示PPMO耗尽eIF4E。“Scr”和“4E”分别表示“扰码”或“eIF4E”PPMO处理的细胞。PPMO处理的VSV中病毒蛋白的（E-F）合成速率重量或VSVG1670A型-感染细胞在10分钟脉冲后[35S] 蛋氨酸。定量分析是指eIF4E缺失细胞与PMO处理细胞的合成速率之比。误差条表示与两个独立重复平均值的标准偏差。
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