miR-15a/-16 Inhibit Angiogenesis by Targeting the Tie2 Coding Sequence: Therapeutic Potential of a miR-15a/16 Decoy System in Limb Ischemia

doi:10.1016/j.omtn.2019.05.002

.2019年9月6日17:49-62。

doi:10.1016/j.omtn.2019.05.002。 Epub 2019年5月17日。

miR-15a/-16通过靶向Tie2编码序列抑制血管生成：miR-15a/16诱饵系统在肢体缺血中的治疗潜力

附属公司

¹英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所。
²英国伦敦帝国理工学院国家心肺研究所。
^三英国伦敦帝国理工学院临床科学研究所；新加坡杜克大学-新加坡国立大学医学院计算生物学中心心血管和代谢障碍项目。
⁴英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所；英国爱丁堡大学BHF心血管科学中心。
⁵英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所；英国伦敦帝国理工学院国家心肺研究所。电子地址：c.emanueli@emperial.ac.uk。

PMID： 31220779
预防性维修识别码： PMC6586592型
内政部： 2016年10月10日/2011年5月21日

miR-15a/-16通过靶向Tie2编码序列抑制血管生成：miR-15a/16诱饵系统在肢体缺血中的治疗潜力

玛丽·贝斯尼尔等。摩尔核酸. 2019.

.2019年9月6日17:49-62。

doi:10.1016/j.omtn.2019.05.002。 Epub 2019年5月17日。

附属公司

¹英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所。
²英国伦敦帝国理工学院国家心肺研究所。
^三英国伦敦帝国理工学院临床科学研究所；新加坡杜克国立大学医学院计算生物学中心心血管和代谢疾病项目，新加坡。
⁴英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所；英国爱丁堡大学BHF心血管科学中心。
⁵英国布里斯托尔大学布里斯托尔心脏研究所；英国伦敦帝国理工学院国家心肺研究所。电子地址：c.emanueli@emperial.ac.uk。

PMID： 31220779
预防性维修识别码：第586592页
内政部： 2016年10月10日/2011年5月21日

摘要

从miR-15a/miR-16-1簇转录的MicroRNA-15a（miR-15a）和miR-16抑制缺血后血管生成。微RNA（miRNA）与mRNA编码序列（CDS）结合是一种新兴的基因表达调控机制。我们的目的是（1）鉴定miR-15a和-16抗血管生成作用的新介质，（2）开发一种基于腺病毒（Ad）的miR-15a/16诱饵系统，该系统携带荧光素酶报告子（Luc）来感知和抑制miR-15a/16的活性，以及（3）研究Ad.Luc-decoy-15a/16在小鼠肢体缺血（LI）模型中的治疗潜力。LI增加小鼠肌肉内皮细胞（EC）中miR-15a和-16的表达。在暴露于血清饥饿但不缺氧的培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，miRNAs也增加。利用生物信息学工具和荧光素酶活性测定，我们表征了miR-15a和-16与Tie2 CDS的结合。在HUVEC中，miR-15a或-16过度表达降低了蛋白水平的Tie2，但不降低mRNA水平。相反，miR-15a或-16抑制以Tie2依赖性方式改善血管生成。局部Ad.Luc-Decoy-15a/16递送增加了缺血骨骼肌中的Tie2水平，改善了LI后血管生成和灌注恢复，减少了脚趾坏死。生物发光成像（体内成像系统[IVIS]）提供了Ad.Luc-Decoy-15a/16系统对miR-15a/16增加反应的证据。总之，我们提供了局部miR-15a/16抑制LI治疗潜力的新机制证据。

关键词：IVIS；第2级；血管生成；血管生成素；缺血；miR诱饵；miR-15a；miR-16a；微RNA；小鼠缺血模型。

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数字

图1
miR-15a、-15b、-16和-503在人类组织中的表达通过RT-PCR和骨骼肌（E）中每个miRNA的相对表达评估人类组织中miR-15a（A）、miR-16（B）、miR-15b（C）和miR-503（D）的表达。结果被归一化为小核RNA U6（U6）表达（n=1/组织，由三个不同的供体样本汇集而成）。

图2
肢体缺血后小鼠内收肌和肌源性内皮细胞中miR-15a和-16的表达受到不同调节。在手术诱导肢体缺血后1天和3天，收集缺血和对侧（对照）内收肌，通过RT-PCR检测miR-15a和-16在总肌肉组织（A）和肌源性CD146+内皮细胞（EC）（B）中的表达。结果被归一化为相对于正常灌注的对照肌肉或EC的小核RNA U6的表达，并表示为平均值±SEM。每种情况n=3**与对照组相比，p<0.01和***p<0.001，与缺血后时间相匹配。

图3
Tie2被miR-15a和-16通过Tie2 mRNA上的一个异常结合位点靶向，并参与抑制HUVEC中miR-15a-16的促血管生成作用*体外试验*（A） HEK293T细胞与前miR-15a（miR-15a）、前miR-16（miR-16）、二者的组合（miR-15 A/16）或miR-加扰寡核苷酸（Scr）和含有荧光素酶开放阅读框（pLUC）的质粒共转染后48小时的荧光素瘤活性，然后是围绕假定的miRNA-结合位点（pLUC-TEK）的50 nt TEK编码序列的一部分。使用miRNA结合位点的突变版本作为对照（pLUC-TEKmut）。还提供了质粒结构的示意图*p<0.05，***p<0.001与pLUC-TEK对照Scr；†与pLUC-TEK相比，p<0.05，††p<0.01达到miRNA前匹配条件（n=5）。（B）用Scramble寡聚物（Scr）、前miR-15a（miR-15a）或前miR-16（miR-16）（5nM）转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs），以增加其各自的成熟miRNA表达。通过RT-PCR评估miR-15a和-16的表达，并将其归一化为小核U6表达。通过RT-PCR和western blot评估Tie2 mRNA（C）或蛋白（D）的表达，并分别归一化为18S和β-actin。每种情况下，n=3。（E）用抗miR-15a、miR-16的Scr寡核苷酸或抗miRNA转染HUVEC，或同时转染两种抗miRNA（总浓度为50 nM）以抑制其活性。通过western blot评估Tie2蛋白表达，并将其归一化为β-肌动蛋白。每种情况下，n=9*与Scr条件相比p<0.05。（F）在转染了Scramble寡核苷酸（Scr）或抗miR-15a或miR-16的抗miRNA（50 nM）的HUVEC中，评估了Tie2对miR-15a/16抑制诱导的血管生成的抑制作用，并用Tie2抑制剂（Tie2-I，5μM）或DMSO对照进行了处理。血管生成能力通过Matrigel上的网络形成进行测量，计算为总长度（单位：毫米），并表示为Scr和DMSO条件下的百分比。提供了代表性图片（比例尺，200μm）。n=3*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。所有结果均表示为平均值±SEM。

图4
携带miR-15a和-16诱饵序列的腺病毒(*Luc-Decoy广告*)传感器活性和抑制效率*在体内*（A）在感染HUVEC的IVIS上测定荧光素酶活性*广告Luc*控制或*Luc-Decoy广告*病毒在完全（2%FBS）或无血清（0%FBS）培养基下培养24小时。结果按细胞表达，并与Ad.匹配，2%FBS条件相关。结果显示为每种条件±SEM的n=4–5的平均值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与Ad.匹配，2%FBS条件#与Ad.-Luc、0%FBS条件、Student t检验相比，p<0.05。（B和C）肢体缺血后，生物发光活性⁻¹●厘米⁻²●sr⁻¹)使用Xenogen IVIS对缺血腿进行测量和分析。将D-荧光素皮下注射到缺血肢体中，与荧光素酶反应产生的生物发光*Ad.Luc公司*-或*Luc-Decoy广告*-从注射病毒后的第1天到第21天，对注射的腿进行测量。展示了具有代表性的图像。数据显示为平均值±SEM（每个条件n≥10）*与时间匹配相比p<0.05广告Luc条件使用Student t检验。（D） miR-15a和-16在表达Luc控制结构的细胞中的抑制、捕获和传感机制的图解解释，缺少miR-15a/16或*Luc-Decoy公司*构造。

图5
通过股动脉结扎诱导小鼠肢体缺血后，抑制miR-15a/16可改善血流（BF）恢复、缺血后新生血管形成和脚趾存活*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*术后立即注入缺血的内收肌。（A和B）折线图显示了注射*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*提供了缺血后第0、7、14和21天拍摄的具有代表性的彩色激光多普勒图像。黄色边框显示分析的缺血性足。数据表示为平均值±SEM（每组n≥10）*与时间匹配相比，p<0.05，**p<0.01广告Luc条件。（C）免疫组织学分析和代表性显微照片显示注射了*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*LI后21天和小鼠对侧（对照）肌肉注射*广告Luc*（每组5例），通过CD31作为内皮细胞标记物的免疫标记进行评估。比例尺，50μm。（D）免疫组织学分析和典型显微照片显示注射*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*肢体缺血后（每组11只或8只），通过α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）作为血管平滑肌细胞标记物的免疫标记进行评估。根据血管直径（<20μm或≥20μm）量化小动脉。数据表示为平均值+SEM。比例尺，20μm。（E）小鼠局部缺血后21天随访中脚趾存活的累积比例*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*（n≥10只/组）。p=0.0013，对数秩检验。（F）肢体缺血手术后3天，缺血内收肌中Tie2的表达及注射*广告Luc*或*Luc-Decoy广告*用RT-PCR和western blot分别在mRNA和蛋白水平上评估病毒。结果归一化为GAPDH用于mRNA分析（n=6）或α/β-微管蛋白用于蛋白质分析（n=9），并表示为平均值±SEM。*p<0.05与*广告Luc*组。

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