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.2019年5月15日；11(5):2784-2800.
2019年电子采集。

FAT4-USP51复合物通过Hippo途径调节子宫内膜癌的增殖和侵袭

小霞车 1, 芳芳健 2, 楠佳 1, 亚正 1, 江亚辉 1, 魏伟峰 1 2
附属机构

FAT4-USP51复合物通过Hippo途径调节子宫内膜癌的增殖和侵袭

小霞车等。 美国翻译杂志. .

摘要

最近的研究发现，FAT肿瘤抑制因子同源物4（FAT4）是粘附连接的重要组成部分，与多种癌症有关。然而，其在子宫内膜癌（EC）中的作用尚不清楚。在本研究中，我们首先分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的552例肿瘤样本和35例非肿瘤样本中FAT4表达与肿瘤分期、肿瘤类型和患者预后之间的关系。我们自己的数据集也证实了EC患者FAT4表达降低与晚期特征（淋巴结转移、淋巴血管浸润和肌肉浸润）的相关性。稳定的FAT4敲除促进EC细胞系的增殖和侵袭。FAT4过表达抑制了亲代细胞表型。FAT4沉默导致LATS1/2和YAP磷酸化降低，而YAP核转位增加，这与促进增殖和侵袭有关。对阴性对照和shFAT4 HEC-1B细胞株进行PCR阵列分析，结果表明，去平衡酶USP51是FAT4相互作用的靶基因。shRNA消融USP51可降低细胞内FAT4蛋白水平，而USP51过度表达可增加FAT4蛋白质水平。免疫共沉淀证实FAT4和USP51直接结合，这对FAT4在EC中的功能至关重要。USP51下调也减弱了FAT4的生长抑制作用。总之，通过灭活去泛素酶USP51抑制FAT4通过抑制Hippo途径促进EC细胞的增殖和侵袭。

关键词：FAT4；河马通路；USP51；子宫内膜癌。

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利益冲突声明

无。

数字

图1
图1
复旦队列和TCGA数据库中人类EC中FAT4的频繁下调。A： 与非肿瘤样本相比，552例子宫内膜癌（EC）样本中FAT4 mRNA表达显著降低。FAT4 mRNA表达下调与晚期相关(*P（P）<0.05,t吨试验）和组织学类型(**P（P）<0.01,t吨测试），而与等级无关。TCGA突变队列分析显示，FAT4突变组的FAT4 mRNA表达相对低于FAT4非突变组(P（P）= 0.022,t吨测试）。B： 与复旦队列中33例正常样本相比，65例EC样本中FAT4 mRNA表达显著降低(***P（P）<0.0001,t吨测试）。与7个EC细胞系相比，宫腔镜检查期间从10名患者提取的原始正常子宫内膜上皮细胞中FAT4 mRNA表达也降低(***P（P）<0.0001,t吨测试）。C： 在TCGA中可获得的多种肿瘤类型中，FAT4的表达也显著下调(*P（P）<0.05, ***P（P）<0.0001,t吨测试）。D、 E:FAT4蛋白在7个EC细胞系中的表达通过免疫荧光和Western blot检测。FAT4蛋白在HEC-1A和HEC-1B细胞系中的表达相对较高，而在RL95-2细胞系中表达较低。
图2
图2
EC组织中FAT4蛋白的表达。A： EC组织、非癌组织和正常组织中FAT4、USP51、LATS1/2和YAP的免疫组织化学染色。原始放大倍数为×100和×400，比例尺分别为100μm和50μm。B： 116个EC组织（EC）和120个正常组织（NT）中FAT4、USP51、LATS1/2和YAP阴性（-或+）或阳性（++或++）的样本比例。C： 与FAT4高表达的患者相比，FAT4低表达的EC患者的总体生存期较差(**P（P）<0.01，对数秩检验）。采用Kaplan-Meier方法绘制累积生存曲线。D： 通过皮尔逊系数测量FAT4、USP51、LATS1/2和YAP四个分子评分的相关性。E： 河马信号通路的核心成分，包括LATS1、LATS2、TAZ和YAP。TCGA RNA-Seq分析显示，与35例非癌样本相比，552例肿瘤样本中LATS1、LATS2和YAP mRNA表达下调，而TAZ则表现出相反的趋势(*P（P）<0.05, ***P（P）<0.0001,t吨测试）。
图3
图3
沉默FAT4促进EC增殖，过度表达FAT4抑制EC增殖。A： HEC-1A、HEC-1B和RL95-2细胞中嘌呤霉素的IC50值。B： 在HEC-1A和HEC-1B细胞中，FAT4在mRNA和蛋白质水平上的敲除（shFAT4）效率。数据为平均值±SD，t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. C： 在RL95-2细胞中上调dCas9、FAT4mRNA和FAT4蛋白水平的效率。数据表示为平均值±SD，t吨-测试***P（P）<0.001。D-F：与阴性（非靶向）对照（NC）相比，HEC-1B和HEC-1A细胞系中FAT4的敲除（shFAT4）显著促进EC细胞增殖；与NC相比，RL95-2细胞上调（sgRNA）FAT4显著抑制EC细胞增殖，t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. G： HEC-1B和HEC-1A细胞中FAT4的敲除（shFAT4）显著增加了EC细胞集落形成，而RL95-2细胞中的FAT4上调（sgRNA）显著降低，t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图4
图4
在HEC-1A、HEC-1B和RL95-2细胞系中，FAT4抑制EC细胞周期进展、细胞侵袭并改变细胞周期相关蛋白标记和侵袭相关蛋白标记。A、 B：流式细胞术检测显示G1期细胞百分比下降，G2期细胞比例随之增加，而在FAT4沉默的HEC-1A和HEC-1B细胞中，S期细胞百分比保持稳定。数据表示为平均值±SD，t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. C： 流式细胞术分析显示，上调HEC-1B-NC细胞中的FAT4可增加G1期细胞群，上调HEC-1B-shFAT4细胞中的FAT4可在FAT4沉默后挽救增殖增加。数据为平均值±SD，t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. D： Western blotting结果显示，与HEC-1A-NC和HEC-1B-NC细胞相比，HEC-1A-shFAT4和HEC-2B-shFAT5细胞中CDK1、CDK2、细胞周期蛋白A1+A2、细胞周期素D1和细胞周期蛋白D2的表达增加。与RL95-2阴性对照细胞相比，这些标记物在FAT4表达上调的RL95-2-sgRNA细胞中的表达降低。数据以平均值±SD表示，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. E、 F:FAT4在HEC-1A和HEC-1B细胞系中的敲除均显著促进EC细胞的迁移和侵袭，如粘附和跨孔细胞迁移和侵袭实验所示。这些数据报告为每个跨孔膜中五个随机区域的平均细胞数。每个样品测试三份**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001,t吨测试。G： FAT4调节迁移相关标记的表达。HEC-1A和HEC-1B细胞感染NC或shFAT4，β-catenin、N-cadherin、P-Smad2和P-Smad3的表达显著降低，E-cadherin表达增加，Smad2、Smad3表达稳定。RL95-2细胞感染NC或sgRNA1-3，β-catenin、N-cadherin、P-Smad2和P-Smad3的表达显著上调，E-cadherin下调，Smad2、Smad3稳定表达。GAPDH起到了装载控制的作用。数据表示为平均值±SD，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图5
图5
FAT4在体内抑制EC的致癌性。A： 用NC或shFAT4转染HEC-1B细胞，并将其注射到BALB/c裸鼠皮下（0.2 mL，1×106单元格）。每3天监测肿瘤大小和重量。沉默FAT4显著促进EC肿瘤生长，数据为平均值±SD*P（P）<0.05,t吨测试。C： 用NC或sgRNA2转染RL95-2细胞，并将其注射入BALB/C裸鼠皮下（0.2 mL，1×106单元格）。每3天监测肿瘤大小和重量。上调的FAT4显著抑制EC肿瘤生长，数据为平均值±SD*P（P）<0.05,t吨测试。B和D：移植瘤切片中FAT4和Ki67的IHC染色*P（P）<0.05时，t吨测试。人的相关性。
图6
图6
改变的FAT4水平调节了Hippo信号通路，并对HEC-1B-NC和HEC-1B-shFAT4进行了PCR-阵列分析，其中包括70种常见的泛素和氘蛋白酶。A： 在感染NC或shFAT4的HEC-1A和HEC-1B细胞以及感染NC或sgRNA的RL95-2细胞中，Hippo通路核心调节剂（LATS1、LATS2、MST1、MST2、TAZ和YAP）的mRNA表达。数据表示为平均值±SD，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. B： 感染NC或shFAT4的HEC-1A和HEC-1B细胞以及感染NC或sgRNA的RL95-2细胞中LATS1、P-LATS1，LATS2，P-LATS2、YAP和P-YAP蛋白的表达。数据表示为平均值±SD，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. C： FAT4阻遏增加了YAP的核积累。与NC细胞（HEC-1A和HEC-1B）相比，FAT4沉默细胞的细胞质P-YAP表达降低，核YAP水平升高，细胞质总YAP水平保持稳定。GAPDH和组蛋白3用作负荷对照。数据表示为平均值±SD，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. D、 E：FAT4调节的差异基因的聚类分析和火山图，红点代表上调基因，绿点代表下调基因；F： 通过感染NC或shFAT4的HEC-1A和HEC-1B中的FAT4验证显著调控的基因（USP45、USP46、USP51、TRAF2、RNF19A、IRAK1和RNF181）。数据以平均值±SD表示，t吨测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图7
图7
抑制USP51有助于促进与USP51直接相关的FAT4和FAT4的致瘤功能，以调节相互表达。A： 复旦队列EC组织与正常组织相比USP51 mRNA表达下调(***P（P）<0.001,t吨测试）；B： TCGA数据库中EC组织与非癌组织相比USP51 mRNA表达降低(***P（P）<0.001,t吨测试）；C： USP51在7种EC细胞系中的蛋白表达；D： 在HEC-1B-shFAT4和HEC-1A-shFAT5细胞株中过度表达USP51，在RL95-2+dCas9+sgRNA2细胞株中敲除USP51(**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001,t吨测试）；E-G：增加USP51可挽救沉默的FAT4在HEC-1B细胞系中的促进增殖功能，而HEC-1A无显著性。降低USP51可挽救上调的FAT4对RL95-2细胞增殖的抑制作用(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，单向方差分析）；H： 基于TCGA数据库的FAT4和USP51相关性的mRNA表达（Person相关性=0.467）；一： 验证感染NC或shFAT4的HEC-1A和HEC-1B以及感染NC或sgRNA的RL95-2中USP51的蛋白表达；J： 检测转染NC或shUSP51的HEC-1B细胞中USP51和FAT4的蛋白表达；转染NC或ovUSP51质粒的RL95-2细胞。K： 用CoIP法检测HEK293T细胞株中FAT4与USP51的直接连接。
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