Non-canonical translation initiation in yeast generates a cryptic pool of mitochondrial proteins

doi:10.1093/nar/gkz301

.2019年6月20日；47(11):5777-5791.

doi:10.1093/nar/gkz301。

酵母中的非标准翻译起始产生一个线粒体蛋白质的隐性库

附属公司

¹芬兰奥鲁大学生物化学与分子医学学院，邮政信箱5400，FIN-90014。
²波兰华沙02-106华沙大学生物学院遗传与生物技术研究所。
^三波兰华沙02-109国际分子和细胞生物学研究所。
⁴波兰华沙大学新技术中心，02-097。

PMID： 31216041
预防性维修识别码： PMC6582344型
内政部： 10.1093/nar/gkz301号

酵母中的非标准翻译起始产生一个线粒体蛋白质的隐性库

杰弗里·蒙特尤伊斯等。核酸研究. 2019.

.2019年6月20日；47(11):5777-5791.

doi:10.1093/nar/gkz301。

附属公司

¹芬兰奥鲁大学生物化学与分子医学学院，邮政信箱5400，FIN-90014。
²波兰华沙02-106华沙大学生物学院遗传与生物技术研究所。
^三波兰华沙02-109国际分子和细胞生物学研究所。
⁴波兰华沙大学新技术中心，02-097。

PMID： 31216041
预防性维修识别码： PMC6582344型
内政部： 10.1093/nar/gkz301

摘要

非AUG替代翻译起始位点的利用在细菌和病毒中最为常见，但在其他生物体中也有报道。这种现象通过允许单个基因表达多种蛋白质亚型，增加了蛋白质组的复杂性。在酿酒酵母中，少数描述的案例涉及从上游近同源起始密码子翻译为定位于线粒体的N末端延伸变体的蛋白质。使用生物信息学工具，我们提供了令人信服的证据，证明在酵母中，通过非AUG翻译起始产生替代蛋白质亚型的潜力比之前预期的要普遍得多，可能适用于多达数千种蛋白质。据预测，数百名候选者将获得线粒体靶向信号（MTS），从而产生未知的线粒体蛋白质库。我们确认了以前未鉴定为线粒体的蛋白质子集的线粒体定位，其标准形式不携带MTS。我们的数据强调了非标准翻译启动在扩大线粒体蛋白质组的能力方面的潜力，可能还包括其他细胞特征。

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数字

**图1。**
替代起始位点（aTIS）在酵母细胞中很常见。(A类)概述*生物信息学*（左侧面板）和体内本工作中使用的（右侧面板）管道。根据列出的NTE的非AUG或上游AUG（uAUG）密码子和NTT的下游AUG（dAUG）编码子翻译而来的替代蛋白质亚型由(B类). 随后使用MitoProt II、TargetP和MitoFates以及核糖体分析（Ribo-seq）对每个亚型进行MTS预测。使用两种方法验证选定的线粒体靶向NTE候选体的线粒体定位体内方法，然后是详细的案例研究（底部面板）。(C类)生物信息学筛选结果。这些列包含筛选中包含的基因数量和筛选产生的基因/蛋白质，如下所示：NTE/NTT生成基因、NTE/NTT-含亚型、NTE/NTT-MTS增益和NTE/NTT-MTS丢失的NTE/NTT/NTT蛋白质（见正文）。这些行是指SGD中所有带注释的ORF，根据Ribo-seq分析，筛选出合并、删除或可疑ORF的高置信ORF，以及翻译中使用的ORF。(D类)核糖体分析中观察到的翻译起始位点（TIS）数量。(E类)预测和使用的起始密码子数、规范AUG、dAUG、uAUG、上游非AUG和所有上游TIS。(F类)替代TIS的相对翻译水平的密度图。对于利用至少一个NTE作为典型TIS上游/下游RPKM的比率的每个基因，计算上游（NTE，红色）和下游（NTT，蓝色）翻译的部分。只有靠近标准TIS的NTE和CDS的前50个密码子（编码序列）被认为是导致CDS 5′端核糖体密度人为升高的“密码子斜坡”的原因。(**G公司**)具有一个额外aTIS的NTE蛋白的标准和非AUG密码子的相对翻译水平分布。(**H（H）**)转录本和翻译水平相对于每个基因的绝对转录本和译文水平的散点图。平移分数按（F）计算；转录分数表示包含给定亚型的mTIF（主要转录亚型；（43））与给定基因mTIF总数的比率。红点和蓝点分别对应下游和上游蛋白质亚型。当转录亚型覆盖TIS上游至少5个核苷酸时，它被认为包含特定TIS。(我)Ribo-seq分析支持从一个TIS翻译的蛋白质的密码子使用效率。(J型)线粒体靶向N-末端延伸（MT-NTE）蛋白的MTS概率。这些数字显示了使用MitoProt II、TargetP或MitoFates预测的最大MTS值。(K)根据本研究中确定的（10）和“MTS增益”蛋白质，描述线粒体相关和高置信线粒体蛋白质数量的维恩图。

**图2。**
通过遗传分析测试的选定候选人的线粒体定位。(A类)经过测试的候选人名单。标准MTS和NTE MTS列分别显示了蛋白质从主要AUG密码子或替代非AUG密码元翻译时MTS的预测值（MitoProt II、TargetP和MitoFates预测的得分平均值）。NTE长度表示假定非AUG启动亚型的N末端延伸长度，粗体数字表示MTS概率分数最高的亚型，如NTE MTS列所示）。分类是指线粒体蛋白质组中蛋白质的分类（10）。(B类)用12个候选蛋白进行代表性α-互补分析。α-互补分析的示意图（左上面板）。与β-半乳糖苷酶α片段及其ω片段融合的候选蛋白在同一腔室中的共定位导致蓝色菌落（左图），而缺乏共定位则产生白色菌落（右图）。细胞色素，胞浆；线粒体、线粒体、Kgd2和Aco1被用作阳性线粒体对照，而无功能MTS的细胞溶质α片段和核/细胞溶质蛋白Gic1的lacZα融合变体作为阴性对照。(C类)（A）中列出的具有代表性的12种筛选蛋白的裂解-内肽-GFP亚细胞定位分析。Split-Intein-GFP分析的示意图（左上面板）。候选蛋白由一个强启动子表达，融合到GFP的HA标记的N末端，然后是分裂内含子的N内含子结构域，与一个线粒体报告子共表达，该线粒体报告子包含一个可切割的MTS，然后是一个分裂内含子和GFP的C末端结构域的HA标记C内含子结构区。附加到测试者GFP-N内含子上的功能性MTS N末端将以测试者为靶点，通过荧光显微镜观察GFP荧光的重建，即使只有一小部分候选蛋白定位于线粒体（右图）。Kgd2和Aco1作为阳性线粒体对照，而不含MTS和Gic1的N-内含子作为阴性对照。线粒体（红色）用Mitotracker复染。(D类)沿着mRNA编码的受试蛋白质的核糖体密度A位点谱。显示的是分别跨越注释的AUG密码子上游或下游-75至+175的密码子区域。每个潜在的上游起始密码子都用对应于热图（每个图下方）的颜色的垂直线表示，该颜色代表MitoProt II预测的每个亚型的MTS值。

**图3。**
通过生化分析测试的选定候选人的线粒体定位(A类)受试候选人名单。关于图2A的说明。(B类)对总（T）酵母提取物进行Western blot分析，并将其分为胞质（C）和线粒体（M）或致密线粒体（D，8倍浓缩）部分。用过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）抗体检测C-末端TAP标记蛋白；带有特定抗体的Trr1、Ilv2（线粒体控制）和Sgt2（细胞质控制）。(C类)AUG启动的Mtr4和Lsm1变异体不定位于线粒体。使用抗HA（血凝素）抗体对表达主要AUG密码子N末端HA-标记蛋白的酵母菌株的细胞溶质（C）和线粒体（M，D）部分进行Western blot分析。(D类)沿着mRNA编码的受试蛋白质的核糖体密度A位点谱。图2D的说明。

**图4。**
Has1的N末端延伸亚型定位于线粒体的效率高于主要亚型(A类)Has1方案^重量和Has1^中频变体。的表达式*HAS1型^重量*可能产生AUG（细胞溶质）和非AUG（线粒体）启动的亚型，而*HAS1型*^中频由于位置-1处的移码突变（缺失）导致AUG框架中出现上游终止密码子，因此只给出了起始于AUG密码子的蛋白质。在aTIS框架中，AUG下游的STOP密码子导致截短的功能失调肽（Has1*）的翻译，该肽可能被降解。（上面板）AUG和NTE亚型MTS评分（MitoProtII）表*哈斯1^重量*和*哈斯1^中频*.（下面板）。(B类)*has1Δ*表达Has1的菌株^重量或Has1^中频具有呼吸能力，生长在含甘油的培养基上。SCG，含甘油培养基；YPD，含葡萄糖的培养基。(C类)Has1的表达^中频导致线粒体编码的细胞色素c氧化酶亚基水平降低。使用特异性抗体对Cox1、Cox2和Cox3进行Western blot分析*has1Δhas1^重量*和*has1Δhas1*^中频菌株。采用孔蛋白作为负荷控制。(D类)Has1的α-互补分析^重量和Has1^中频变体。如图2B所示。(E类)Has1的分裂Intein-GFP亚细胞定位分析^重量和Has1^中频蛋白质。如图2C所示。右侧的图表表示从3D堆栈成像中获得的Mander和Pearson的共定域系数。结果为平均值(n个=5），误差条代表SD；*表示统计显著性（学生t吨-测试**P（P）*< 0.05).

**图5。**
Trz1定位于线粒体，作为从非AUG密码子翻译的NTE变体。(A类)编码Trz1变异体的不同结构的示意图（顶面板）及其通过分馏酵母提取物的西方分析预期的定位（下面板）。TTC和ATG分别表示上游非规范和标准翻译起始密码子；TAP——串联亲和纯化标签；p41XADH–用于*TRZ1型*构造。(B类)缺乏Trz1^UUC公司上游非标准密码子翻译的亚型导致呼吸缺陷表型。对照组（WT BY4741和*TRZ1/TRZ1Δ*BY4743）和*trz1Δ*表达Trz1变异体的菌株，如右图所示。(C类)通过细胞溶质（C）和线粒体（M或D，致密，八倍浓缩）组分的西方分析对Trz1变异体进行细胞定位。如图3B所示。

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1. Gonczarowska-Jorge H.，Zahedi R.P.，Sickmann A.面包酵母线粒体的蛋白质组。线粒体。2017; 15–21.-公共医学
1. von Heijne G.、Steppuhn J.、Herrmann R.G.。线粒体和叶绿体靶向肽的结构域。欧洲生物化学杂志。1989年；180:535–545.-公共医学
1. Sokol A.M.、Sztolsztener M.E.、Wasilewski M.、Heinz E.、Chacinska A.。存活和健康的线粒体蛋白转座子。FEBS信函。2014; 588:2484–2495.-公共医学
1. Gakh O.，Cavadini P.，Isaya G.，线粒体加工肽酶。生物化学。生物物理学。《学报》。2002; 1592:63–77.-公共医学
1. Kunze M.，Berger J.。蛋白质导入不同细胞器的N末端靶向信号之间的相似性及其进化相关性。前面。生理学。2015; 6:1–27.-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Gonczarowska-Jorge H.，Zahedi R.P.，Sickmann A.面包酵母线粒体的蛋白质组。线粒体。2017; 15–21.-公共医学

[2] Gonczarowska-Jorge H.，Zahedi R.P.，Sickmann A.面包酵母线粒体的蛋白质组。线粒体。2017; 15–21.-公共医学

[3] von Heijne G.、Steppuhn J.、Herrmann R.G.。线粒体和叶绿体靶向肽的结构域。欧洲生物化学杂志。1989年；180:535–545.-公共医学

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[5] Sokol A.M.、Sztolsztener M.E.、Wasilewski M.、Heinz E.、Chacinska A.。存活和健康的线粒体蛋白转座子。FEBS信函。2014; 588:2484–2495.-公共医学

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[7] Gakh O.，Cavadini P.，Isaya G.，线粒体加工肽酶。生物化学。生物物理学。《学报》。2002; 1592:63–77.-公共医学

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[9] Kunze M.，Berger J.。蛋白质导入不同细胞器的N末端靶向信号之间的相似性及其进化相关性。前面。生理学。2015; 6:1–27.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Kunze M.，Berger J.。蛋白质导入不同细胞器的N末端靶向信号之间的相似性及其进化相关性。前面。生理学。2015; 6:1–27.-项目管理咨询公司-公共医学

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