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.2019年6月14日；38(1):258.
doi:10.1186/s13046-019-1225-9。

胰腺肿瘤球体和星状细胞三维共培养模型中基质介导的癌细胞侵袭、基质重塑和药物反应的多重定量分析

Hyun Ju黄 1, Min-Suk哦 1, 李东宇（Dong Woo Lee） 2 三, Hyo-Jeong Kuh先生 4 5 6
附属公司

胰腺肿瘤球体和星状细胞3D共培养模型中基质介导的癌细胞侵袭、基质重塑和药物反应的多重定量分析

Hyun Ju黄等。 实验临床癌症研究杂志. .

摘要

背景：胰腺导管腺癌（PDAC）是一种富含基质的癌，胰腺星状细胞（PSCs）是这种致密基质的主要组成部分。PSC通过与癌细胞的相互作用在转移进展和化疗耐药中发挥重要作用。侵袭性表型的临床前体外肿瘤模型应结合肿瘤细胞和细胞外基质中PSC的三维培养，以实现临床相关性和可预测性。

方法：使用我们先前开发的微柱芯片将PANC-1细胞培养为肿瘤球体（TS），并与PSC共同培养，两者均包埋在胶原凝胶中。研究了PSC共培养对ECM纤维网络、癌细胞侵袭性迁移和上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白表达的影响。条件培养基还分析了参与癌细胞与PSC相互作用的分泌因子。在与PSC共同培养的PANC-1 TS中，以等毒性浓度比较吉西他滨和紫杉醇对癌细胞侵袭的抑制作用。

结果：为TS的生长、PSC的激活及其相互作用优化了共培养条件。在TS-PSC共培养中，通过ECM重塑、侵入体形成和EMT增加癌细胞侵袭，以及耐药性，似乎是通过多种分泌因子（包括IL-6、IL-8、IGF-1、EGF、TIMP-1、uPA、PAI-1和TSP-1）与癌细胞-PSC相互作用介导的。与吉西他滨相比，紫杉醇表现出更大的抗侵袭活性，这归因于抑制癌细胞内的侵入体形成，以及PSC特异性细胞毒性，消除其旁分泌信号。

结论：在这里，我们利用微柱组织芯片作为PDAC的新型肿瘤模型，建立了PANC-1细胞和PSC的TS的三维共培养。我们的结果表明，目前的共培养模型和多重定量分析方法不仅在研究PSCs的作用及其与肿瘤细胞的相互作用对转移进展的影响方面有用，而且在基质靶向药物的药物评价方面也有用。

关键词：3D共培养；肿瘤侵袭；基质重塑；紫杉醇；胰腺星状细胞；肿瘤微环境；肿瘤球体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

微型阵列芯片的专利申请和注册已由韩国天主教大学提出。作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
TS和PSC共培养条件的优化。一癌症细胞的示意图-使用微柱芯片和96倍板进行PSC共培养，随后在免疫荧光染色后进行共焦显微镜检查。b条五种胰腺癌细胞系中EMT状态（E-cadherin和vimentin表达水平；绿色）与球体表面粗糙度之间的关系。c（c）比较五种胰腺癌细胞系中球体的数量和大小。d日共培养时TSs和PSCs的形态和活力（钙黄绿素AM）。细胞是在没有细胞的情况下生长的(b条和c（c）)和存在(d日)6个PSC 天。在井板培养期间对整个TS和PSC进行染色，并在2 μm(b条), 10 μm(c（c）)和5 μm(d日)间隔并堆叠成z投影。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。比例尺：50 微米
图2
图2
与PANC-1球体共同培养时PSCs的激活。一与PANC-1球体共同培养时细胞形状和长度的变化。b条在与TSs共培养的PSCs中，α-SMA和TGF-β1的表达增加。7天后进行免疫染色 96-well板块的文化日。光学切片采集时间为5 μm(一)和1.5 μm(b条)间隔并堆叠成z投影。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。每个场至少分析50个细胞。比例尺：200 微米*第页 < 0.05, **第页 < 0.01
图3
图3
基质蛋白纤维的分布和形态变化。PSC共培养对I型胶原表达水平和厚度的影响(一)和纤维连接蛋白(b条). 黄色箭头表示TS外围的ECM束。c（c）正常（非浸润性）基质和膜突起近端基质（侵袭性）胶原纤维的角度分布差异。7之后 培养天，对TS的冷冻切片进行免疫染色(一和b条)或整个TS(c（c）). 光学切片采集于1 μm的间隔，并堆叠成z投影。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。比例尺：50 微米*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001
图4
图4
PSC共培养对PANC-1 TS细胞侵袭的影响。一PSC共培养条件下球体大小和形状的变化。b条肿瘤细胞从TS中侵袭的三个不同阶段。具有细胞核伸长的细胞用白色箭头表示，并比较保留在球体内的细胞和侵入基质的细胞之间的细胞核长宽比。c（c）PSC共培养条件下具有侵袭性形态的TS比例增加。在一些球体周围可以看到侵入体（黄色箭头）和分散的单细胞（黄色星号）。对包含至少30个球体的截面区域进行分析，以确定其侵入阶段为非侵入性、侵入性或侵入性，如(b条). 比较细胞侵袭情况，计算球体外基质中分散的单个细胞数量，并在培养第9天比较单培养TS和与PSCs共同培养的TS。在TS的冷冻切片上进行核DAPI（蓝色）或F-actin（红色）染色(一)或整个TS(b条和c（c）). 共聚焦光学截面在1 μm（a和b）或7 μm(c（c）)间隔并堆叠成z投影。TS：肿瘤球体。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。比例尺：50 微米***第页 < 0.001
图5
图5
在PSC共培养条件下，PANC-1 TS中EMT相关蛋白的表达增加。一免疫荧光和western blot分析测定E-cadherin、vimentin、α-SMA、TGF-β1和β-catenin表达水平的变化。b条PSC共培养条件下Ki-67表达增加。7天后对TS的冷冻切片进行免疫荧光染色 文化日。光学切片采集于1 μm间隔，并堆叠成z投影。从球形培养物的整个切片上测量荧光强度，并用DAPI强度进行归一化。插页中显示了单个TS。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。比例尺：50 微米*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001
图6
图6
与PSCs共同培养的PANC-1 TS CM中趋化因子和细胞因子分泌增加。一单培养和PSC共培养条件下PANC-1 TS CM中人类细胞因子阵列分析的代表性图像。共培养CMs（黄盒）中只检测到两个因子；在共培养条件下（红框），其中5个表现出5倍以上的增长。图中是显示增加2倍以上的因素。b条TS-PSC共培养条件下CM中TGF-β1和EMT相关细胞因子的上调。CM：条件培养基；POS：阳性对照；NEG：阴性对照
图7
图7
紫杉醇抑制癌细胞的侵袭并抑制PSC的活性。一暴露于GEM或PTX时，TS中细胞侵袭和EMT因子表达的变化。对整个TS（钙黄绿素AM和F-actin）和冷冻切片（波形蛋白和TGF-β1）进行染色。黄色箭头和星号分别表示入侵昆虫和分散的单细胞。b条暴露于GEM或PTX的PSCs的细胞形态和成纤维细胞活化因子的变化。c（c）药物治疗后CM中四种EMT相关细胞因子的表达变化。d日PTX诱导抑制TS和PSC之间的相互激活和细胞因子串扰的拟议机制示意图。光学部分在1.5时采集 μm间隔，并堆叠成z投影。比较两种药物浓度下的药物效果，使存活率降低30%（IC30)72之后 h暴露，即180 GEM和3的μM PTX的μM（附加文件3:图S3-a）。TS：肿瘤球体；GEM：吉西他滨；PTX：紫杉醇；CM：条件培养基。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD。比例尺：100 微米*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 与对照组相比为0.001
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