Colorectal cancer-derived extracellular vesicles induce transformation of fibroblasts into colon carcinoma cells

doi:10.1186/s13046-019-1248-2

.2019年6月14日；38(1):257.

doi:10.1186/s13046-019-1248-2。

大肠癌衍生细胞外囊泡诱导成纤维细胞转化为结肠癌细胞

穆罕默德·阿卜杜¹, 马蒂奥·弗洛里斯², 祖华高^三, 文森佐竞技场⁴, 曼努埃尔竞技场⁵, 戈弗雷多·奥拉齐奥竞技场^6 7

附属公司

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所癌症研究项目，H4A 3J1。
²意大利萨萨里Piazza Universita 11 Sassari大学生物医学系。
^三加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所病理学系，H4A 3J1。
⁴圣巴姆比诺医院妇产科，途经意大利卡塔尼亚Torre del Vescovo 4。
⁵卡塔尼亚大学外科、器官移植和先进技术系，途经意大利卡塔尼亚圣索菲亚84号。
⁶加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所癌症研究项目，H4A 3J1。goffredo.arena@mcgill.ca。
⁷加拿大魁北克省蒙特利尔市拉科姆大街3830号圣玛丽医院麦吉尔大学外科，H3T 1M5。goffredo.arena@mcgill.ca。

PMID： 31200749
预防性维修识别码： PMC6567673型
内政部： 10.1186/s13046-019-1248-2

大肠癌衍生细胞外囊泡诱导成纤维细胞转化为结肠癌细胞

穆罕默德·阿卜杜等。实验临床癌症研究杂志. 2019.

.2019年6月14日；38(1):257.

doi:10.1186/s13046-019-1248-2。

作者

穆罕默德·阿卜杜赫¹, 马蒂奥·弗洛里斯², 祖华高^三, 文森佐竞技场⁴, 曼努埃尔竞技场⁵, 戈弗雷多·奥拉齐奥竞技场^6 7

附属公司

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所癌症研究项目，H4A 3J1。
²意大利萨萨里Piazza Universita 11 Sassari大学生物医学系。
^三加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所病理学系，H4A 3J1。
⁴圣巴姆比诺医院妇产科，途经意大利卡塔尼亚Torre del Vescovo 4。
⁵卡塔尼亚大学外科、器官移植和先进技术系，途经意大利卡塔尼亚圣索菲亚84号。
⁶加拿大魁北克省蒙特利尔市迪卡里大道1001号麦吉尔大学健康中心研究所癌症研究项目，H4A 3J1。goffredo.arena@mcgill.ca。
⁷加拿大魁北克省蒙特利尔市拉科姆大街3830号圣玛丽医院麦吉尔大学外科，H3T 1M5。goffredo.arena@mcgill.ca。

PMID： 31200749
预防性维修识别码： PMC6567673型
内政部： 10.1186/s13046-019-1248-2

摘要

背景：我们报道，恶性特征向靶细胞的水平转移是解释癌症传播的潜在途径。尽管这些结果令人鼓舞，但从未有数据证实这些结果与所观察到的现象的分子机制有关。

方法：在本研究中，我们将BRCA1-KO成纤维细胞暴露于从结肠癌细胞系（HT29）和结直肠癌患者血清中分离的细胞外囊泡（EVs）。暴露三周后，将成纤维细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠体内。对接触癌EV前后的癌EV和成纤维细胞进行全基因组测序、转录组分析和RNA测序。

结果：异种移植的组织病理学研究证实了成纤维细胞向结肠癌细胞的典型转化。我们观察到，EV介导的癌症microRNAs转移负责处理后的成纤维细胞从间充质向上皮表型（MET）的转变，以及细胞周期进展和细胞生存途径的激活。DNA和RNA测序表明，癌症DNA被转移并可能在靶细胞中转录。此外，在NOD-SCID小鼠的尾静脉中注射结肠癌EV确定了小鼠肺部的肿瘤转化和转移，首次证实了将恶性上皮癌性状转移到远处靶细胞的假设是适用于体内模型的概念。

结论：这些发现为恶性性状水平转移背后的分子机制提供了新的线索，并证实了转移性疾病可能通过循环遗传物质的转移而再现的观点。

关键词：大肠癌；胞外小泡；遗传物质；水平转移；转移。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
结直肠癌EV增加*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞增殖并降低其细胞死亡率. *巴西航空公司1*-KO成纤维细胞培养3 在存在从对照人血清或癌症患者血清中分离的EVs的情况下数周(一,**c（c）**)和对照培养基或从HT-29细胞系条件培养基分离的EV(**b、 c（c）**). 分析细胞的生长潜力(一,b条)和细胞活力(**c（c）**).一和b条计算每一通道的人口倍增能力。插入图和柱形图中的数据表示治疗期结束时的累积人口倍增。柱形图表示来自10名对照组和13名癌症患者血清的汇总数据(一)和来自5个对照组与5个独立批次的HT29条件培养基(b条). 数据均为平均值 ± 标准偏差。*P（P）*值在柱状图上表示。(**c（c）**)使用AnnexinV和7-AAD染色，然后通过流式细胞仪分析处理细胞的细胞活力。细胞在双参数FSC/SSC图中被选通（G1）。绘制凋亡细胞（AnnexinV阳性和7AAD阴性）的百分比以进行比较。柱形图表示来自5个对照组与5个癌症患者血清的汇总数据，以及来自4个对照组和4个独立批次HT29条件培养基的汇总数据。数据均为平均值 ± SD.P值在柱状图上表示

图2
癌症EVs在体外将恶性特征转移到靶细胞。*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞治疗3次用从癌细胞条件培养基、癌患者血清或相应对照中分离出的EV进行治疗。将处理后的细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠体内，并随访4年肿瘤生长数周。将发育中的肿瘤切除、固定并用石蜡包埋。对组织切片进行H&E染色或用Ki67、波形蛋白、CDH1、CEA、CDX2、CK7、CK20和AE1/AE3抗体进行免疫标记。显示了具有代表性的图片。数据代表了接触HT29细胞条件培养基中分离的EV的五种细胞培养物和接触结直肠癌血清中EV的十三种细胞培养。比例尺：50 微米

图3
癌症电动汽车将遗传物质货物转移至*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞。一用吖啶橙（AO）标记EV以标记DNA和*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞暴露于这些EV 24 h.显示代表性图像。箭头指向进入细胞核的EV衍生DNA（绿色）（用DAPI标记为蓝色）。比例尺：20 微米。b条用BrUTP转染HT29细胞。对转染（2）或未转染（1）细胞的Aliquotes进行RNA中BrUTP掺入分析。请注意，几乎所有细胞都将BrUTP纳入其RNA中（样本2）。然后，从转染细胞中收集条件培养基以分离EV。*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞与这些EV接触（4）或不接触（3）12 小时。n个 = 2个独立实验。**c（c）**HT29条件培养基或EV用DNase、RNase或两者处理或不处理。*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞治疗3次用这些培养基培养数周后，将处理过的细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠体内，随后随访4周肿瘤生长时间为周。数据为平均值+/-SD。n个 = 2-3只小鼠**P（P）* < 0.05

图4
暴露于*巴西航空公司1*-癌EV的KO成纤维细胞改变了其转录组特征。一和b条PCA映射和层次聚类表明*巴西航空公司1*-暴露于EV的KO成纤维细胞与未暴露细胞的聚集性不同。此外，EV聚集在远离细胞的地方。**c（c）**，EVs暴露细胞和非暴露细胞之间的差异基因表达。数据是通过3种独立的细胞培养获得的。过滤标准设置如下：折叠变化：> 2或 < − 2和FDRP（P）价值< 0.05.d日，微阵列数据挖掘的准确性。基于免疫组化标记数据的读出基因列表（图1）

图5
*巴西航空公司1*-暴露于癌细胞EVs的KO成纤维细胞经历间充质-上皮转化（MET），增殖增加，细胞凋亡减少。*巴西航空公司1*-KO成纤维细胞治疗3次用从HT29癌细胞条件培养基中分离出的EV培养周。分离并处理RNA以进行微阵列分析。一显示了涉及MET、细胞周期进展和细胞生存相关基因的三条主要途径。绿色和红色分别突出显示暴露于EVs的细胞中上调和下调的基因。b条和**c（c）**，上调(b条)并下调(**c（c）**)EVs暴露细胞中的基因。以−为界的基因表达 2和2以及FDR P值< 0.05显示。n个 = 3种独立的细胞培养。●磷酸化**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001

图6
MET过程相关基因差异表达的验证。一、幼稚成纤维细胞（BJ）（1），*巴西航空公司1*-对未经处理（2）或用从HT29癌细胞条件培养基（3）中分离的EV处理的KO成纤维细胞和从HT29细胞条件培养液（4）或结直肠癌患者血清（4）中分离出的EV进行间充质（SNAI、ZEB、CDH2、Vimentin和Fibronectin）、上皮（CDH1）、，细胞周期调节因子（CDKN1A、MYC和HRAS）和凋亡调节因子（MDM2和BCL2L1）标记。结果代表了一个实验进行了两次。数据为平均值+/-SD。n个 = 2. **P（P）* < 0.05. 注意，数据以Log表示。比例。b条，样本与中的相同(一)通过免疫印迹分析间充质（Vimentin；VIM）和上皮（CDH1）标记物的表达。β-actin被用作蛋白质负载的校准物。该表显示了相应样品中的蛋白质水平。n个 = 2个独立实验

图7
暴露于*巴西航空公司1*-癌EV的KO成纤维细胞改变了其miRNA表达模式。一和b条PCA映射和层次聚类表明*巴西航空公司1*-暴露于癌症EVs的KO成纤维细胞与未暴露的细胞不同地聚集。此外，EV聚集在远离细胞的地方。**c（c）**，EVs暴露细胞和非暴露细胞之间的miRNA差异表达。数据是通过3种独立的细胞培养获得的。过滤标准设置如下：折叠变化：> 2或 < − 2和FDR P值< 0.05

图8
mRNA/miRNA相互作用网络源自描述MET过程中转录物的微阵列分析。已从mirtarbase数据库中检索到连接(网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw). 显示了截止值为2的基因表达。n个 = 3种独立的细胞培养。参见在线附加文件1：表S4和表S5了解表达水平

图9
癌症EV在体内转移恶性特征。每隔一天在NOD-SCID小鼠尾静脉注射一次从MC38细胞条件培养液中分离的EV，持续5天周。四周后，采集肺部进行拍照和分析。对组织切片进行H&E染色或用Ki67、CEA、CDX2、CK7、CK20、AE1/AE3、TTF1和Napsin抗体进行免疫标记。显示了具有代表性的图片。数据代表了三只暴露小鼠肺部的染色表现。比例尺：50 微米

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