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.2019年6月14日;38(1):259。
doi:10.1186/s13046-019-1262-4。

USP13通过阻断NF-kB介导的PTEN在膀胱癌中的下调而发挥抑癌作用

附属公司

USP13通过阻断NF-kB介导的PTEN在膀胱癌中的下调而发挥抑癌作用

小君满等。 实验临床癌症研究杂志. .

勘误表in

摘要

背景:USP13已被报道参与人类肿瘤的发生,但其在膀胱癌(BC)中的功能作用和调控机制尚不清楚。

方法:采用q-RT-PCR检测miR-130b-3p、miR-301b-3p和USP13在BC组织中的表达。通过Western blot、q-RT-PCR、生物信息学分析和双核糖核酸酶报告子分析鉴定miR-130b-3p/301b-3p对USP13的调节作用。进行免疫共沉淀分析以评估USP13和PTEN蛋白之间的相互作用。采用细胞连接试剂盒8、集落形成试验和穿孔试验评价BC细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。建立小鼠BC细胞异种移植模型,验证USP13在体内的功能。免疫组织化学检测临床/异种移植瘤组织中USP13、NF-kB p65或PTEN的蛋白表达。

结果:我们的研究表明,USP13通过与PTEN蛋白相互作用并增加其在膀胱癌中的表达而发挥抑癌作用。我们发现USP13的缺失导致PTEN的下调,并促进膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。此外,我们发现USP13是miR-130b-3p和miR-301b-3p的共同靶点,以及miR-130b/301b簇,其可被NF-kB转录上调。我们的数据表明,NF-kB激活降低USP13和PTEN的表达水平,并促进BC细胞的肿瘤发生表型。此外,USP13的再次引入部分挽救了PTEN的表达以及NF-kB引起的肿瘤发生趋势。

结论:我们报告了一个潜在的调节环,即NF-kB诱导的miR-130b/301b过度表达降低了USP13的表达,随后导致PTEN蛋白的下调,并促进膀胱癌的发生。此外,NF-kB介导的PTEN下调很可能促进NF-kB的完全激活。

关键词:膀胱癌;NFκB;PTEN;美国药典13。

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利益冲突声明

作者声明,他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
USP13是miR-130b/301b的共同靶点,并且USP13在BC组织中的表达显著升高。USP13的表达(),miR-130b-3p(b条)和miR-301b-3p(c(c))实时PCR检测50对正常膀胱粘膜组织和膀胱癌组织。e(电子)采用Pearson相关系数检验评估50例膀胱癌组织标本中USP13和miR-130b-3p/miR-301b-3p表达的相关性。转录((f))和平移(小时)通过实时PCR分析和western blotting分析分别测定miR-130b/301b过度表达或敲除BC细胞中USP13的水平。i、。miR-130b-3p和miR-301b-3p的共同种子序列,以及USP13基因3'UTR区域的miRNA反应元件。列出了miR-130b/301b的USP13’UTR和agomir的突变。j。在与含有USP13基因野生型3'UTR或突变型3'UTR的荧光素酶构建物共同转染的miR-130b/301b过表达5637细胞中测量荧光素酶活性。k、。用含有USP13野生型3'UTR和miR-130b/301b agomir或突变型miR-130b/301b agumir的荧光素酶构建物共同转染5637个细胞,测定其荧光素酶活性。对于实时PCR,使用β-actin和U6 snRNA作为mRNA和miRNA的内部对照,使用2-ΔΔCt方法比较各组的Ct值*P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01,由学生的T检验确定
图2
图2
miR-130b/301b和USP13的体外生物学功能。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测量细胞增殖能力(b条)测定和菌落形成测定(e(电子))miR-130b/301b过度表达5637和UM-UC-3细胞。CCK-8型(c(c))和菌落形成分析((f))还进行了USP13敲除5637和UM-UC-3细胞的细胞增殖评估。在miR-130b/301b过度表达的细胞中,通过跨阱分析测定细胞的侵袭和迁移能力(小时)或USP13分解(j个)5637和UM-UC-3细胞。CCK-8检测细胞增殖(k个)和菌落形成分析()USP13单独敲除或USP13敲除以及PTEN表达恢复5637和UM-UC-3细胞。细胞侵袭性()和迁移(n个)通过Transwell法测定单独敲除USP13或敲除USB13以及PTEN表达恢复的5637和UM-UC-3细胞的容量。原始放大倍数:400×*P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01,由学生的T检验确定
图3
图3
USP13通过直接相互作用维持PTEN表达。a。western blot分析检测了USP13敲除5637和UM-UC-3细胞中USP13、PTEN以及磷酸-AKT和AKT的表达,并对其带强度进行了定量分析b条.c。将miR-130b/301b的agomir转染到5637和UM-UC-3细胞中,随后恢复USP13的表达。Western blotting分析用于评估USP13和PTEN的表达,在.e、。miR-130b/301b在5637和UM-UC-3细胞中被敲除,并通过western blotting分析检测USP13和PTEN的表达,在(f).g、。NF-kB p65在5637细胞中过表达,然后将miR-130b、miR-301b或pLvx-USP13的agomir分别转染到NF-kBp65过表达细胞中。通过western blotting分析测定磷-65、USP13和PTEN的表达,并在小时.i、。293用Flag标记的USP13或空载体转染T细胞24小时h、 然后进行TNF-a或相关载体治疗12h.用抗Flag M2微球对裂解液进行免疫沉淀。结合蛋白用USP13或PTEN抗体进行western印迹分析,带强度在j个内部控制基因为GAPDH用于western blot分析,β-actin用于实时PCR分析。凝胶在相同的实验条件下运行。利用Image J 1.46r软件计算谱带强度,并利用靶基因与GAPDH的比值进行统计分析*P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01,由学生的T检验确定
图4
图4
NF-kB/miR-130b~301b/USP13轴的体外生物学功能. a-e公司。通过转染pLvx-NF-kB p65,NF-kBp65在BC细胞中过度表达,然后转染miR-130b/301b或USP13过表达的antagomir。采用CCK-8法和细胞集落形成法测定细胞增殖指数。每组表示为:1个空载体;2 NF-kB p65过表达;3 NF-kB p65过表达与miR-130b敲除;4 NF-kB p65过表达与miR-301b敲除;5 NF-kB p65过度表达,USP13表达恢复。f-h。细胞侵袭和迁移能力通过Transwell分析测定。这些细胞按中所述进行分组(). 原始放大倍数:400×*P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01,由学生的T检验确定
图5
图5
USP13或PTEN的再表达部分挽救了体内肿瘤的生长和转移。a。异种移植小鼠模型的体内肿瘤块由4种类型的UM-UC-3细胞组成:空载体、NF-kB过度表达、NF-kB过度表达与USP13再表达、NF-kB过度表示与PTEN再表达。注射后第50天处死小鼠,并将每个肿瘤块从体内移除。b。体内肿瘤体积的肿瘤生长曲线。数据显示为平均值±肿瘤体积的标准差,n个 = 5, *P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01(方差分析)。c。各组的平均肿瘤重量。数据显示为平均值±肿瘤重量的标准偏差,n个 = 5. *P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(方差分析)。d。异种移植瘤中NF-kB、USP13和PTEN的IHC染色。IHC评分采用基于每个部分三个不同区域阳性细胞数量的数字评分进行评估,评分为0表示无阳性细胞;1表示10%阳性细胞;2表示10–50%阳性细胞;3例阳性细胞占450%。每个样品评估一个截面,每组5个样品。NF-kB p65、USP13或PTEN的IHC评分见e、 如果分别为(*P(P) < 0.05,学生t检验)。小时。小鼠肺转移结节切除后的图像(上部面板). 通过注射四种类型的细胞(如)通过尾静脉进入裸鼠体内。对肺部进行苏木精-伊红染色,并在显微镜下捕获和计数转移结节的数量(小时:下面板,). 对每组每5个切片的肺转移数进行统计分析(*P(P) < 0.05和**P(P) < 0.01,方差分析)
图6
图6
高PTEN水平与人类膀胱癌组织样本子集中USP13过度表达相关。a。30例膀胱癌患者膀胱癌组织标本PTEN和USP13免疫组织化学染色的代表性图像。b。BC组织标本中PTEN或USP13染色的定量。PTEN或USP13的染色强度为0-3(0:无染色,1:弱染色,2:中等染色,3:强染色。0和1分为低表达,2和3分为高表达。PTEN高表达与USP13高表达相关(第页 < 0.05,费希尔精确测试)
图7
图7
机械图说明了NF-kB/miR-130b~301b簇/USP13轴的信号转导。NF-kB通过诱导miR-130b/301b的转录降低USP13的表达,从而抑制PTEN的表达。另一方面,PTEN通过抑制PI3K/AKT信号调节NF-kB的活性。NF-kB诱导PTEN表达缺失的调节环促进NF-kB的组成性激活和膀胱癌的发生

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