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.2019年5月22:12:3953-3962。
doi:10.2147/OTT。第186613条。 2019年eCollection。

血清饥饿通过miR-224诱导NSCLC细胞死亡

王国勤 1, 江琼韩 2, 李庄 1, 李世娟 1, 全功 1, 陈云兰 三
附属公司

血清饥饿通过miR-224诱导非小细胞肺癌细胞死亡

王国勤等。 Onco目标Ther. .

摘要

目的：越来越多的证据表明，微小RNA（miRNA）可能参与非小细胞肺癌（NSCLC）的发生和发展。在本研究中，我们使用血清饥饿的A549细胞在微环境中的营养耗竭应激下模拟肿瘤。患者和方法：我们首先检测了miR-224在肿瘤组织和邻近正常组织之间的表达水平。我们使用定量实时PCR（qRT-PCR）分析饥饿A549细胞中miR-224及其预测的靶向磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的表达水平。在饥饿的A549细胞中转染miR-224模拟物或抑制剂后，进行MTT分析、Annexin V FITC/PI染色和LC-3免疫荧光染色，以研究miR-224.在增殖、凋亡和自噬中的作用。接下来，使用qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、自噬相关蛋白LC3、PI3K信号和靶PTEN的表达。miR-224和PTEN之间的直接相互作用通过双荧光素酶分析进行验证。结果：我们发现，与邻近正常组织相比，肿瘤组织中miR-224的表达水平显著升高。我们发现，在饥饿的A549细胞中，miR-224和PTEN之间存在相互表达模式，用miR-224miR-224-模拟物转染导致PTEN下调。双荧光素酶分析进一步证实了PTEN的miR-224和3'UTR之间的直接相互作用。在饥饿的A549细胞中转染miR-224模拟物后，细胞增殖增强，凋亡减少，自噬增加，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax和自噬相关蛋白LC3表达降低。在miR-224模拟转染细胞中观察到PI3K的激活。在所有实验中观察到miR-224抑制剂的逆转作用。结论：综上所述，我们证明miR-224可能通过调节靶向PTEN和下游信号PI3K，在营养缺乏的A549细胞的细胞功能中发挥重要作用，这表明miR-229有可能成为非小细胞肺癌的治疗靶点。

关键词：非小细胞肺癌；PI3K；PTEN；miR-224；血清饥饿。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者报告说，在这项工作中没有利益冲突。

数字

图1
图1
miR-224在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达上调。miR-224在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于邻近正常组织**第页<0.01.
图2
图2
在A549细胞饥饿模型中，miR-224下调，并与PTEN呈负相关。在A549细胞饥饿模型中进行miR-224和PTEN mRNA表达的qRT-PCR分析。(A）饥饿模型中miR-224的表达显著低于对照组。（B）在饥饿模型中PTEN的表达显著上调。结果是相对于对照值表达的（设为1.0作为参考值）**第页<0.01.缩写：CON，控制；NC，阴性对照；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；qRT-PCR，定量实时PCR。
图3
图3
miR-224模拟物或抑制剂对细胞活力的影响。用miR-224模拟物/模拟物NC或miR-224inhibitor/抑制剂NC转染细胞。(A类——B类)使用qRT-PCR证实miR-224的表达。结果是相对于对照值表达的（设为1.0作为参考值）**第页<0.01.(C类——D）采用MTT法检测A549细胞的活性。数据显示为在490 nm处测量的光密度**第页<0.01.缩写：CON，控制；NC，阴性对照；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；qRT-PCR，定量实时PCR。
图4
图4
miR-224模拟物或抑制剂对细胞凋亡的影响。(A–D)通过Annexin V-FITC/PI染色后的流式细胞术评估miR-224模拟物/模拟物NC或miR-224inhibitor/抑制剂NC转染后的细胞凋亡。图中显示了典型的散点图**第页<0.01.缩写：CON，控制；NC，阴性对照。
图5
图5
miR-224模拟物或抑制剂对细胞自噬的影响。(A–D)在转染miR-224模拟物或miR-224inhibitor的细胞中观察到LC3的免疫荧光**第页<0.01。(E类——H（H）)使用Western blot分析转染miR-224模拟物或miR-224inhibitor的LC3B-II/I蛋白表达**第页<0.01.缩写：CON，控制；NC，阴性对照。
图6
图6
miR-224模拟物或抑制剂对缺血状态下A549细胞中Bcl-2、Bax和p-PI3K的影响。(A类——F类)qRT-PCR检测miR-224模拟物或miR-224inhibitor转染细胞中凋亡相关基因Bcl-2、Bax和PI3K的表达水平**第页<0.01。(G公司——J型)使用Western blot分析Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K p85、AKT和p-AKT的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制**第页<0.01.缩写：CON，控制；NC，阴性对照；qRT-PCR，定量实时PCR。
图7
图7
转染miR-224模拟物或抑制剂的细胞中PTEN mRNA和蛋白水平。(A类——B类)用miR-224模拟物或miR-224inhibitor转染后的细胞中PTEN mRNA水平通过qRT-PCR分析进行定量。结果是相对于对照值表达的（设为1.0作为参考值）**第页<0.01。(C类——天)用Western blot分析转染miR-224模拟物或miR-224inhibitor后细胞内PTEN蛋白水平。缩写：CON，控制；NC，阴性对照；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；qRT-PCR，定量实时PCR。
图8
图8
PTEN是miR-224的直接靶点。(A类)序列比对显示了miR-224结合位点在PTEN 3′UTR中的相对位置，并显示了突变的核苷酸。序列用于构建荧光素酶报告质粒。(B类)每个报告构建物（p-PTEN-wt或p-PTEN-mut）在HEK293T细胞中与miR-224模拟物或NC共转染，24小时后测量双荧光素酶分析。荧光素酶活性按Renilla标准化，并表示为相对于miR-阴性对照（任意设置为1）。数据以三个独立实验的平均值±SD表示**第页<0.01.缩写：NC，阴性对照；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；WT，野生型。
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