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.2019年7月10日；39（7）：英国标准20182196。
doi:10.1042/BSR20182196。 2019年7月31日印刷。

microRNA-613通过下调FN1使AKT信号通路失活对鼻咽癌细胞的抗血管生成作用

如高 1, 乔蕾·冯 2, 谭国林 3
附属公司

microRNA-613通过下调FN1使AKT信号通路失活，从而对鼻咽癌细胞产生抗血管生成作用

如高等。 Biosci代表. .

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摘要

背景：鼻咽癌是一种对放射治疗高度敏感的疾病，其病因尚不清楚。然而，microRNA-613（miR-613）对鼻咽癌的特异性作用仍不明确。因此，本研究通过调控纤维连接蛋白1（FN1），通过AKT信号通路探讨了鼻咽癌中miR-613的潜在机制。方法：首先，使用微阵列分析筛选与鼻咽癌相关的差异表达基因（DEG）和调节性miR。接下来，测定了miR-613和FN1在NPC细胞中的表达，随后验证了miR-613和FN1之间的靶点关系。将鼻咽癌细胞暴露于miR-613模拟物、si-FN1和LY294002（AKT信号通路抑制剂）下，通过B细胞淋巴瘤2/Bcl-2-相关X蛋白（Bcl-2/Bax）、Cleaved-caspase3、基质金属肽酶2（MMP-2）、，测定MMP-9、血管内皮生长因子（VEGF）和细胞粘附分子-1（CD31）的表达。然后，在裸鼠中进行异种移植后的肿瘤发生和MVD测定。结果：miR-613调控的FN1通过AKT信号通路对鼻咽癌至关重要。鼻咽癌细胞miR-613表达下调，FN1表达上调。此外，miR-613被证实是针对FN1的。此外，过度表达的miR-613、沉默的FN1或LY294002治疗抑制了NPC细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成，这表现为AKT、mTOR、MMP-2、MMP-9、VEGF和CD31的表达减少，Bcl-2/Bax的比率降低，Claved-caspase3的表达增加。此外，miR-613过表达、沉默FN1或LY294002治疗可促进裸鼠细胞凋亡，抑制肿瘤发生和MVD。结论：总之，miR-613通过灭活FN1依赖的AKT信号通路抑制NPC细胞的血管生成。

关键词：AKT信号通路；FN1；入侵；MicroRNA-613；迁移；鼻咽癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

数字

图1
图1。miR-613通过冥想FN1通过AKT信号通路参与鼻咽癌的发展
(A类–D类)NPC微阵列数据中前50个DEG的热图，其中横坐标表示样本数，纵坐标表示基因名称，左树状图显示基因表达的聚类。每个小方框表示样本中基因的表达；(E类)鼻咽癌微阵列数据中DEGs的文氏分析。图中的四个椭圆表示四个不同NPC微阵列数据的DEG，中间部分表示四个微阵列数据结果的交集；(F类)四个微阵列数据交叉的22个基因的基因相互作用网络；(G公司)预测调节FN1的miRs。图中的六个三角形表示六个数据库中的预测结果，中间部分表示预测结果的交集；(H（H）)miR-613和FN1在NP69、CNE1、CNE2、HONE1和5-8F细胞系中的相对表达*P（P）与NP69细胞株相比<0.05。(我)Western blot分析检测FNI蛋白水平。测量数据表示为平均值±标准偏差；两组之间的数据通过配对进行比较t吨-测试；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复了三次。
图2
图2。FN1是miR-613的靶基因
(A类)目标扫描网站中miR-613与FN1的结合位点；(B类)miR-613模拟物转染后FN1-Wt和FN1-Mut的荧光素酶活性*P（P）与NC组相比<0.05；(C类)CNE1细胞中miR-613和FN1改变后FN1蛋白带的灰度值；(D类)用miR-613和FN1转导后CNE1细胞中FN1的蛋白表达；(E类)在HONE1细胞中用miR-613和FN1处理后的FN1蛋白带的灰度值；(F类)用miR-613和FN1处理HONE1细胞后FN1的蛋白表达*P（P）与NC-mimic组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；两组之间的数据由未配对者进行比较t吨-测试；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复三次；Wt，野生型；哑巴，突变型。
图3
图3。上调miR-613或下调FN1有助于抑制细胞增殖、侵袭和迁移，并促进HONE1细胞的凋亡
(A类)模拟或抑制剂miR-613和FN1处理后HONE1细胞的增殖以及EdU检测到的LY294002处理（200×）；(B类)流式细胞术检测模拟或抑制剂miR-613和FN1以及LY294002处理后HONE1细胞的凋亡；(C类)Western blot分析HONE1细胞中Bcl-2、Bax、Claved-caspase3蛋白带；(D类)用模拟或抑制剂miR-613和FN1处理HONE1细胞后，以及用Transwell分析检测到的LY294002处理后的细胞迁移（200×）；(E类)用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂处理HONE1细胞后，以及用Transwell分析检测到的LY294002处理后细胞侵袭（200×）；(F类)Western blot分析检测用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及LY294002处理后HONE1细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达。&P（P）与空白组相比<0.05*P（P）与NC模拟组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；@P（P）与miR-613模拟组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复了三次。
图4
图4。上调miR-613或下调FN1有助于抑制细胞增殖、侵袭和迁移，并促进CNE1细胞的凋亡
(A类)用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及EdU检测到的LY294002处理后CNE1细胞的增殖（200×）；(B类)流式细胞术检测miR-613和FN1模拟物或抑制剂以及LY294002处理后CNE1细胞的凋亡；(C类)通过蛋白质印迹分析检测CNE1细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3的蛋白带；(D类)用模拟或抑制剂miR-613和FN1处理CNE1细胞后，以及用Transwell分析检测到的LY294002处理后的细胞迁移（200×）；(E类)用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂处理CNE1细胞后，以及用Transwell分析检测到的LY294002处理后的细胞侵袭（200×）；(F类)Western blot分析检测用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及LY294002治疗后CNE1细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达。&P（P）与空白组相比<0.05*P（P）与NC模拟组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；@P（P）与miR-613模拟组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复了三次。
图5
图5。miR-613的过度表达或FN1的沉默可抑制鼻咽癌细胞的血管生成
(A类)通过试管形成实验检测miR-613和FN1模拟物或抑制剂以及LY294002处理后CNE1细胞的血管生成能力（100×）；(B类)用试管形成实验检测miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及LY294002处理后HONE1细胞的血管生成能力（100×）；(C类)用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及LY294002治疗后CNE1细胞中血管生成相关因子（VEGF和CD31）的蛋白表达（Western blot分析）；(D类)Western blot分析检测用miR-613和FN1的模拟物或抑制剂以及LY294002处理后HONE1细胞中血管生成相关因子（VEGF和CD31）的蛋白表达。&P（P）与空白组相比<0.05*P（P）与NC模拟组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；@P（P）与miR-613模拟组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复了三次。
图6
图6。miR-613过表达通过下调FN1导致AKT信号通路失活
(A类)Western blot分析CNE1细胞AKT、mTOR、p-AKT和p-mTOR蛋白带的灰度值；(B类)CNE1细胞AKT和mTOR蛋白表达及磷酸化程度；(C类)Western blot分析检测HONE1细胞AKT、mTOR、p-AKT和p-mTOR蛋白带的灰度值；(D类)HONE1细胞中AKT和mTOR的蛋白表达和磷酸化程度。&P（P）与空白组相比<0.05*P（P）与NC模拟组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；@P（P）与miR-613模拟组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；多组间数据采用单因素方差分析进行比较；实验重复了三次。
图7
图7。miR-613上调或FN1下调导致裸鼠肿瘤发生和血管生成受到抑制
(A类)转染后裸鼠的肿瘤体积；(B类)裸鼠肿瘤重量生长曲线；(C类)裸鼠肿瘤重量；(D类)免疫组织化学检测异种移植物MVD（400×）；(E类)肿瘤MVD直方图。&P（P）与空白组相比<0.05*P（P）与NC模拟组相比<0.05；#P（P）与si-NC组相比<0.05；@P（P）与miR-613模拟组相比<0.05；测量数据表示为平均值±标准偏差；多组间的数据通过单因素方差分析或重复测量方差分析进行比较。
图8
图8。miR-613通过调节FN1通过AKT信号通路介导NPC迁移、侵袭和血管生成的调节机制
miR-613过度表达和FN1沉默使AKT信号通路失活，从而抑制NPC的侵袭、迁移和血管生成，对应于Bcl-2、MMP-2、MMP-9、VEGF和CD31的下调，以及Bcl-2/Bax比率的降低和Claved-caspase3表达的增加。
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