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.2019年7月；20(1):529-538.
doi:10.3892/mmr.2019.10285。 Epub 2019年5月23日。

红景天苷通过mTOR/p70S6K信号传导促进细胞自噬，保护SH-SY5Y免受致病性α‑突触核蛋白的影响

陈莎莎 1, 冯才 2, 王吉荣 1, 杨周欣 1, 池谷 2, 王国富 1, 毛根祥 1, 井研 1
附属公司

红景天苷通过mTOR/p70S6K信号传导促进细胞自噬，保护SH-SY5Y免受致病性α‑突触核蛋白的影响

陈莎莎等。 分子医学代表. 2019年7月.

摘要

α-synuclein（α-syn）的异常聚集是帕金森病（PD）的重要病理特征，对多巴胺能神经元具有细胞毒性，导致细胞损伤和凋亡。红景天苷（SAL）是中药红景天的主要活性成分。先前的研究表明，SAL对细胞衰老和神经变性具有细胞保护作用。然而，SAL在PD中的作用和作用机制尚不清楚。本研究利用α‑syn的野生型过度表达和A53T突变在SH‑SY5Y细胞中诱导PD神经元模型，导致神经元毒性和细胞增殖指数降低。SAL以剂量依赖性的方式增加了两个PD模型组的细胞增殖指数。此外，SAL减轻了致病性磷酸化（Ser129）α‑syn的表达以及微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）‑I与LC3‑II的表达比例，这与自噬功能有关。此外，结果表明，SAL诱导的PD模型神经元保护的潜在机制可能涉及自噬的保存，自噬主要通过mTOR/p70S6K减弱神经元中α-syn的磷酸化，并且独立于PI3K/Akt信号通路。

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数字

图1。
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SAL通过α-syn聚集以剂量依赖的方式保护帕金森病模型神经元。（A） 通过western blotting检测转染WT-或A53T-α-syn过表达质粒的SH-SY5Y细胞的WT或A53Tα-syn-过表达。上面的红色字母表示A53Tα-syn的突变位点。（B） 未经SAL治疗（0µM SAL）的三个神经元组（模拟、WT和A53T）的相对细胞增殖指数比较。与模拟组相比，WT组和A53T组在24和48 h的增殖指数均降低。（C）SAL处理对三组SH-SY5Y细胞活力的影响。各组神经元分别用不同浓度的SAL（0、10和20µM）处理24 h和48 h。（D）各组神经元用不同浓度SAL处理的Hoechst染色。蓝色箭头（标尺，100µm）表示细胞核致密且染色严重的凋亡神经元。（E） SAL治疗（10或20µM）亚组SH-SY5Y细胞的相对凋亡指数显著低于无SAL治疗的（0µM。单因素方差分析用于评估多组数据。所有数据均以平均值±标准差表示。*P<0.05**P<0.01。SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；WT，野生型；α-syn，α-synuclein。
图2。
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SAL降低了SH-SY5Y帕金森病模型神经元中pSer129-α-syn的表达并恢复了自噬。（A） 对每组SH-SY5Y细胞（模拟、WT和A53T）中的pSer129-α-syn进行Western blot分析，并进行各种处理（空白、DMSO、10µM SAL、20µM SIL和阳性对照）。（B） 各组SH-SY5Y细胞（模拟细胞、WT细胞和A53T细胞）中pSer129-α-syn（红色）的免疫荧光染色，24小时后进行不同处理（标尺，50µm）。（C） 对每组SH-SY5Y细胞（模拟细胞、WT细胞和A53T细胞）进行LC3-II/LC3-I蛋白印迹分析，并进行不同处理（空白、DMSO、10µM SAL、20µM SIL和阳性对照）。（D） 24小时后，对每组SH-SY5Y细胞（模拟、WT和A53T）进行不同处理后的LC3-II（绿色）免疫荧光染色（比例尺，50µm）*P<0.05**P<0.01***P<0.001。NS，不显著；SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；WT，野生型；α-syn，α-synuclein；二甲基亚砜；pSer129-α-syn，磷酸化α-syns；LC3，微管相关蛋白1A/1B轻链3。
图2。
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SAL降低了SH-SY5Y帕金森病模型神经元中pSer129-α-syn的表达并恢复了自噬。（A） 对每组SH-SY5Y细胞（模拟、WT和A53T）中的pSer129-α-syn进行Western blot分析，并进行各种处理（空白、DMSO、10µM SAL、20µM SIL和阳性对照）。（B） 各组SH-SY5Y细胞（模拟细胞、WT细胞和A53T细胞）中pSer129-α-syn（红色）的免疫荧光染色，24小时后进行不同处理（标尺，50µm）。（C） 对每组SH-SY5Y细胞（模拟细胞、WT细胞和A53T细胞）进行LC3-II/LC3-I蛋白印迹分析，并进行不同处理（空白、DMSO、10µM SAL、20µM SIL和阳性对照）。（D） 24小时后，对每组SH-SY5Y细胞（模拟、WT和A53T）进行不同处理后的LC3-II（绿色）免疫荧光染色（比例尺，50µm）*P<0.05**P<0.01***P<0.001。NS，不显著；SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；WT，野生型；α-syn，α-synuclein；二甲基亚砜；pSer129-α-syn，磷酸化α-syns；LC3，微管相关蛋白1A/1B轻链3。
图3。
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雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤通过α-syn聚集影响SAL对SH-SY5Y帕金森病模型神经元的保护作用。（A） SH-SY5Y PD模型神经元在不同时间点（0、24和48小时）与不同处理（DMSO、10µM SAL、10µ）M SAL+5µM Rap、10µ》M SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的相对细胞增殖指数比较。（B） 用不同的处理方法（DMSO、10µM SAL、10μM SAL+5µM Rap、10μM SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）对A53T SH-SY5Y细胞进行Hoechst染色。细胞核致密且染色严重的凋亡神经元用粉红色箭头表示（刻度条，100µm）。（C） 24小时后，对A53T SH-SY5Y细胞进行不同处理（DMSO、10µM SAL、10μM SAL+5µM Rap、10μM SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的Western blot分析，以检测pSer129-α-syn表达水平。（D） 各组A53T SH-SY5Y细胞经不同处理后24小时的pSer129-α-syn（红色）免疫荧光染色（标尺，50µm）。采用单因素方差分析对多组患者进行评估。所有数据均以平均值±标准差表示。*P<0.05**P<0.01。SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；Rap、雷帕霉素；3-甲基腺嘌呤；α-syn，α-synuclein；二甲基亚砜；pSer129-α-syn，磷酸化α-syn。
图3。
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雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤通过α-syn聚集影响SAL对SH-SY5Y帕金森病模型神经元的保护作用。（A） SH-SY5Y PD模型神经元在不同时间点（0、24和48小时）与不同处理（DMSO、10µM SAL、10µ）M SAL+5µM Rap、10µ》M SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的相对细胞增殖指数比较。（B） 用各种处理（二甲基亚砜、10µM SAL、10µM SAL+5µM Rap、10µM SAL+1mM 3-MA和阳性对照）对A53T SH-SY5Y细胞进行Hoechst染色。细胞核致密且染色严重的凋亡神经元用粉红色箭头表示（刻度条，100µm）。（C） 24小时后，对A53T SH-SY5Y细胞进行不同处理（DMSO、10µM SAL、10μM SAL+5µM Rap、10μM SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的Western blot分析，以检测pSer129-α-syn表达水平。（D） 各组A53T SH-SY5Y细胞经不同处理后24小时的pSer129-α-syn（红色）免疫荧光染色（标尺，50µm）。采用单因素方差分析对多组患者进行评估。所有数据均以平均值±标准差表示。*P<0.05**P<0.01。SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；雷帕霉素；3-甲基腺嘌呤；α-突触核蛋白；二甲基亚砜；pSer129-α-syn，磷酸化α-syn。
图4。
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SAL通过抑制mTOR/p70S6K的磷酸化来维持A53T SH-SY5Y细胞的自噬。24小时后，对A53T SH-SY5Y细胞进行不同处理（DMSO、10µM SAL、10μM SAL+5µM Rap、10μM SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的Western blot分析，以检测（A）PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、p-PI3K，p-Akt，p-mTOR，p-p70S6K和（B）LC3-II/LC3-I的表达水平，并对上述组间PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号转导中磷酸化蛋白与总相关蛋白的比值进行了比较。（C） 各组A53T SH-SY5Y细胞经不同处理后24小时的LC-II（绿色）免疫荧光染色（比例尺，50µm）*P<0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001。SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；雷帕霉素；3-甲基腺嘌呤；二甲基亚砜；LC3，微管相关蛋白1A/1B轻链3；p、 磷酸化。
图4。
图4。
SAL通过抑制mTOR/p70S6K的磷酸化来维持A53T SH-SY5Y细胞的自噬。24小时后，对A53T SH-SY5Y细胞进行不同处理（DMSO、10µM SAL、10μM SAL+5µM Rap、10μM SAL+1 mM 3-MA和阳性对照）的Western blot分析，以检测（A）PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、p-PI3K，p-Akt，p-mTOR，p-p70S6K和（B）LC3-II/LC3-I的表达水平，并对上述组间PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号转导中磷酸化蛋白与总相关蛋白的比值进行了比较。（C） 各组A53T SH-SY5Y细胞经不同处理后24小时的LC-II（绿色）免疫荧光染色（比例尺，50µm）*P＜0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001。SAL、红景天苷；A53T、A53T突变；雷帕霉素；3-甲基腺嘌呤；二甲基亚砜；LC3，微管相关蛋白1A/1B轻链3；p、 磷酸化。
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