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.2019年8月；44(2):457-468.
doi:10.3892/ijmm.2019.4227。 Epub 2019年5月31日。

丹酚酸B对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用及其机制

山高 1, 李士勤 1, 秦丽 2, 张福勇 三, 孙梦琪 1, 紫林湾 1, 王树荣 4
附属公司

丹酚酸B对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用及其机制

山高等。 国际分子医学杂志. 2019年8月.

摘要

丹酚酸B（Sal B）是丹参的水溶性活性成分，具有抗动脉粥样硬化作用。本研究旨在评估Sal B对过氧化氢（H2O2）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激损伤的细胞保护作用，并探讨其潜在机制。MTT结果显示细胞活力增强，流式细胞仪分析显示H2O2激发的细胞凋亡减少，这表明Sal B保护细胞免受H2O2诱导的损伤。此外，作为一种潜在机制，自噬增强被认为是细胞凋亡减少的原因，因为Sal B在H2O2诱导的氧化应激下导致轻链3‑Ⅱ和Beclin‑1上调，p62下调。最后，Sal B增加了AMP激酶（AMPK）的磷酸化，降低了哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）的磷酸化度，但对AKT的磷酸化没有影响。总之，本研究表明，Sal B通过激活AMPK通路和下调mTOR通路促进自噬，至少部分地保护HUVEC免受氧化应激。

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数字

图1
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丹酚酸B的化学结构。
图2
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通过MTT分析测定细胞活力。（A） HUVEC用H治疗2O（运行）2以指示的浓度。（B） 将HUVEC与指定浓度的Sal B孵育24 h。（C）用Sal B（5、10和20）预处理HUVECsµg/ml）24小时，然后用或不用h处理2O（运行）2(800µM） 24小时的数据代表了三个独立实验（平均值±SEM）；*P<0.05和**与对照组相比P<0.01，##与对照组相比P<0.01。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图3
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Sal B抑制H2O（运行）2-诱导HUVEC凋亡。（A） HUVEC用H治疗2O（运行）2在有或无Sal B的情况下，细胞用Hoechst 33258染色（白色箭头表示凋亡细胞；放大倍数×200）。（B） AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染色对HUVEC细胞凋亡进行流式细胞术分析；（a） 对照组；（b） H（H）2O（运行）2组；（c） H（H）2O（运行）2+ 5µg/ml Sal B组；（d） ，H2O（运行）2+10个µg/ml Sal B组；（e） H（H）2O（运行）2+ 20µg/ml Sal B组。（C） Hoechst量化的凋亡率。（D） 流式细胞术检测细胞凋亡率；Sal B降低H诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡2O（运行）2数据代表三个独立实验（平均值±SEM）；##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。（E） Sal B降低H2O（运行）2-诱导caspase-3活性。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（F） 用不同浓度（5、10、20）培养HUVECµg/ml）的Sal B持续24小时，然后用h刺激2O（运行）2(800µM） 24小时。细胞色素的蛋白质水平c（c）用western印迹法检测裂解的caspase-3或β-actin。条形图显示（G）细胞色素的定量c（c）和（H）裂解半胱天冬酶-3。相对蛋白质水平表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图3
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Sal B抑制H2O（运行）2-诱导HUVEC凋亡。（A） HUVEC用H治疗2O（运行）2在有或无Sal B的情况下，细胞用Hoechst 33258染色（白色箭头表示凋亡细胞；放大倍数×200）。（B） AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双重染色流式细胞术检测HUVEC凋亡；（a） 对照组；（b） 小时2O（运行）2组；（c） H（H）2O（运行）2+ 5µg/ml Sal B组；（d） ，H2O（运行）2+ 10µg/ml Sal B组；（e） 小时2O（运行）2+ 20µg/ml Sal B组。（C） Hoechst量化的凋亡率。（D） 流式细胞术检测细胞凋亡率；Sal B降低H诱导的HUVEC凋亡2O（运行）2数据代表三个独立实验（平均值±SEM）；##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。（E） Sal B降低H2O（运行）2-诱导caspase-3活性。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（F） 用不同浓度（5、10、20）培养HUVECµg/ml）的Sal B持续24小时，然后用h刺激2O（运行）2(800µM） 24小时。细胞色素的蛋白质水平c（c）用western印迹法检测裂解的caspase-3或β-actin。条形图显示（G）细胞色素的定量c（c）和（H）裂解半胱天冬酶-3。相对蛋白质水平表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B、丹酚酸B；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图4
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自噬降低H诱导的HUVEC凋亡2O（运行）2（A）雷帕霉素增加，3-MA降低H诱导的HUVEC的细胞活力2O（运行）2（B）用AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双重染色对HUVEC凋亡进行流式细胞术分析；（a） 对照组；（b） H（H）2O（运行）2组；（c） H（H）2O（运行）2+3-MA组；（d） H（H）2O（运行）2+雷帕霉素组。（C） 流式细胞术检测细胞凋亡率；雷帕霉素降低和3-MA增加H诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡2O（运行）2.##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（D） 通过蛋白质印迹法测定LC3和p62或β-肌动蛋白的蛋白水平。条形图显示了（E）LC3-II和（F）p62的定量。（G） 细胞色素的蛋白质水平c（c）用western印迹法检测裂解的caspase-3或β-actin。条形图显示（H）细胞色素的定量c（c）和（I）裂解半胱天冬酶-3。细胞色素的相对蛋白质水平c（c）、裂解的caspase-3、LC3-II和p62表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；3-甲基腺嘌呤；LC3，轻链3；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图4
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自噬降低H诱导的HUVEC凋亡2O（运行）2（A）雷帕霉素增加，3-MA降低H诱导的HUVEC的细胞活力2O（运行）2（B）用AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双重染色对HUVEC凋亡进行流式细胞术分析；（a） 对照组；（b） H（H）2O（运行）2组；（c） H（H）2O（运行）2+3-MA组；（d） H（H）2O（运行）2+雷帕霉素组。（C） 流式细胞术检测细胞凋亡率；雷帕霉素降低和3-MA增加H诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡2O（运行）2.##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（D） 通过蛋白质印迹法测定LC3和p62或β-肌动蛋白的蛋白水平。条形图显示了（E）LC3-II和（F）p62的定量。（G） 细胞色素的蛋白质水平c（c）用western印迹法检测裂解的caspase-3或β-actin。条形图显示（H）细胞色素的定量c（c）和（I）裂解半胱天冬酶-3。细胞色素的相对蛋白质水平c（c）、裂解的caspase-3、LC3-II和p62表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；3-甲基腺嘌呤；LC3，轻链3；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图5
图5
Sal B促进氧化应激下HUVEC的自噬。（A） Sal B促进自噬流量（放大倍数，×200）。（B） 用Sal B（5、10和20）处理自噬内流（C）HUVEC的定量条形图µg/ml）持续24 h，并通过western blotting测定LC3、p62和Beclin-1或β-actin的蛋白水平。条形图显示了（D）LC3-II、（E）Beclin-1和（F）p62的定量。LC3-II、p62和Beclin-1的相对蛋白质水平表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。#P<0.05和##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；LC3，轻链3；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图6
图6
Sal B促进自噬减少H2O（运行）2-诱导HUVEC凋亡。（A） Sal B通过H2O（运行）23-MA部分减弱了这一点。结果表示为三个独立实验的平均值±SEM。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（B） 膜联蛋白Ⅴ-FITC/碘化丙啶双染色法检测人脐静脉内皮细胞凋亡；（a） 对照组；（b） H（H）2O（运行）2组；（c） 销售B+H2O（运行）2组；（d） Sal B+3-MA组。（C） 流式细胞术检测细胞凋亡率；Sal B减少了细胞凋亡，3-MA部分减弱了细胞凋亡。##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（D） 用Sal B（5、10和20）治疗HUVECµg/ml）持续24 h，并通过western blotting测定LC3或β-actin的蛋白水平。条形图显示了（E）LC3-II和（F）p62的定量。LC3-II和p62的相对蛋白质水平表示为三个独立实验的光密度平均值±SEM。（G） 用Sal B（5、10和20）治疗HUVECµg/ml）24h与细胞色素蛋白水平c（c）用western印迹法测定裂解caspase-3。（H）裂解半胱天冬酶-3和（I）细胞色素的定量c（c）表示为三个独立实验的平均值±SEM，##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。人脐静脉内皮细胞；Sal B，丹酚酸B；LC3，轻链3；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图7
图7
Sal B增加了p-AMPK的蛋白表达并降低了p-mTOR的蛋白表达，导致凋亡率降低，而化合物C降低了p-AMPK的水平并增加了凋亡率。（A） Sal B介导p-AMPK和p-mTOR的蛋白表达，但不影响p-AKT。（B）p-AKT、（C）p-AMPK和（D）p-mTOR的量化表示为三个独立实验的平均值±SEM；#P<0.05和##与对照组相比P<0.01；**与H组相比P＜0.012O（运行）2组。（E） Sal B增加了p-AMPK的蛋白表达，降低了p-mTOR的蛋白表达。（F）p-AMPK和（G）p-mTOR的定量表示为三个独立实验的平均值±SEM。#P<0.05和##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。Sal B、丹酚酸B；AMPK、AMP激酶；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；p-，磷酸化；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
图7
图7
Sal B增加了p-AMPK的蛋白表达并降低了p-mTOR的蛋白表达，导致凋亡率降低，而化合物C降低了p-AMPK的水平并增加了凋亡率。（A） Sal B介导p-AMPK和p-mTOR的蛋白表达，但不影响p-AKT。（B）p-AKT、（C）p-AMPK和（D）p-mTOR的量化表示为三个独立实验的平均值±SEM；#P<0.05和##与对照组相比P<0.01；**与H相比P<0.012O（运行）2组。（E） Sal B增加了p-AMPK的蛋白表达，降低了p-mTOR的蛋白表达。（F）p-AMPK和（G）p-mTOR的定量表示为三个独立实验的平均值±SEM。#P<0.05和##与对照组相比P<0.01；*P<0.05和**与H相比P<0.012O（运行）2组。Sal B，丹酚酸B；AMPK、AMP激酶；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；p-，磷酸化；H（H）2O（运行）2，过氧化氢。
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