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.2019年8月；44(2):617-629.
doi:10.3892/ijmm.2019.4208。 Epub 2019年5月23日。

经典树突状细胞调节脂多糖诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠的急性肺部炎症和损伤

郎丽 1, 梁东 1, 丹·赵 2, 费高 2, 杰燕 2
附属公司

经典树突状细胞调节脂多糖诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠的急性肺部炎症和损伤

郎丽等。 国际分子医学杂志. 2019年8月.

摘要

经典树突状细胞（cDC）参与炎症性肺部疾病的发病机制；然而，它们在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的作用尚不清楚，ARDS是一种病理生理炎症性疾病。本研究旨在探讨肺cDC对脂多糖（LPS）诱导的ARDS急性肺部炎症和损伤的调节作用。分别使用类Fms酪氨酸激酶3配体（FLT3L）和FLT3信号的特异激活剂和抑制剂莱斯陶替尼对C57BL/6小鼠进行连续5天的预处理。气管内注射LPS诱导ARDS，6和24h后处死小鼠。流式细胞术检测肺cDC的聚集和成熟。评估肺湿重与体重的比值（LWW/BW）和组织病理学分析，以评估肺水肿和肺损伤。用ELISA法检测肿瘤坏死因子‑α和白细胞介素（IL）‑6水平，以评价急性肺部炎症。通过ELISA、RT‑qPCR和western blotting定量干扰素‑γ、IL‑1β、IL‑）4和IL‑10的水平，以及转录因子T‑box‑在‑T‑细胞中的表达（T‑bet）和GATA结合蛋白3，以评估Th1/Th2反应的平衡。测定髓过氧化物酶（MPO）活性以评估中性粒细胞浸润。结果表明，LPS攻击后6 h肺cDC的聚集和成熟达到峰值，24 h显著下降。FLT3L预处理进一步刺激肺cDC聚集和成熟，导致肺MPO活性升高，T‑bet表达增加，进而导致LWW/BW加重、急性肺部炎症和损伤。然而，莱斯陶替尼预处理抑制了肺cDC的聚集和成熟，降低了肺MPO活性和T‑bet表达，并最终改善了LWW/BW、急性肺部炎症和损伤。本研究结果表明，肺cDC通过调节中性粒细胞浸润和Th1/Th2反应的平衡来调节LPS诱导的ARDS中的急性肺部炎症和损伤。

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数字

图1
图1
FLT3L和lestaurtinib对肺组织中FLT3信号的调节。分别用逆转录定量PCR和western blotting检测Akt、ERK1/2和STAT5的mRNA和蛋白表达水平，以证实FLT3L和莱斯陶替尼对FLT3信号的调节。（A） Akt的mRNA表达。（B） ERK1/2的mRNA表达。（C） STAT5的mRNA表达。β-actin作为参考基因。（D） Akt、ERK1/2和STAT5及其磷酸化形式的Western blot分析。（E） p-Akt与总Akt水平的比率。（F） p-ERK与总ERK水平的比值。（G） p-STAT5与总STAT5水平的比率。β-actin作为参考蛋白。数据表示为平均值±标准偏差（n=3）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比P<0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。FLT3，Fms样酪氨酸激酶3；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体；p-，磷酸化；急性呼吸窘迫综合征。
图2
图2
肺cDC的聚集和成熟在LPS攻击后6小时达到峰值。流式细胞术检测肺cDC的聚集和成熟。（A） 代表性点图和（B）量化显示cDC的百分比（CD11c+CD11b型+)LPS激发后6小时和24小时，对照组和ARDS组的总肺细胞数。（C） 代表性直方图和（D）量化显示了LPS攻击后6和24小时对照组和ARDS组肺cDC中MHC II的表达。（E） 代表性直方图和（F）定量显示LPS激发后6和24小时对照组和ARDS组肺cDC中CD80的表达。结果以每组6只小鼠在每个时间点获得的值的平均值±标准偏差表示。灰色直方图表示同型对照。*与6小时对照组相比P<0.05；#与6小时ARDS相比P<0.05；和&与24小时对照组相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；脂多糖；急性呼吸窘迫综合征；MHC II，主要组织相容性复合体II类。
图3
图3
FLT3信号转导对肺cDC聚集和成熟的影响。在LPS攻击后6 h，用流式细胞仪测定肺cDC的聚集和成熟度。（A） 代表性点图和（B）量化显示cDC的百分比（CD11c+CD11b型+)在实验组的总肺细胞中。（C） 显示实验组肺cDC中MHC II表达的代表性直方图和（D）定量。（E） 代表性直方图和（F）量化显示了实验组肺cDC中CD80的表达。数据表示为平均值±标准偏差（n=6）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比P<0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。FLT3，Fms样酪氨酸激酶3；cDC，经典树突状细胞；脂多糖；MHC II，主要组织相容性复合体II类；急性呼吸窘迫综合征；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图4
图4
cDC操作对急性呼吸窘迫综合征急性肺部炎症的影响。（A） 采用ELISA法测定LPS激发后6 h的TNF-α和（B）IL-6水平，以评估急性肺部炎症。数据表示为平均值±标准偏差（n=6）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比P<0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；急性呼吸窘迫综合征；肿瘤坏死因子；白细胞介素；脂多糖；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图5
图5
cDC操作对肺水肿和肺损伤的影响。分别在LPS激发后6小时和24小时测量LWW/BW和肺损伤评分，以评估肺水肿和肺损伤。（A） LPS激发后6 h肺组织苏木精和伊红染色（放大倍数×200）和24 h（B）。（C） LPS激发后6 h和24 h的肺损伤评分（D）。（E） LPS激发后6小时的LWW/BW和24小时的（F）。肺损伤评分用任意平均单位表示。数据表示为平均值±标准偏差（n=6）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比，P＜0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；LWW/BW，肺湿重与体重之比；脂多糖；急性呼吸窘迫综合征；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图6
图6
cDC操作对中性粒细胞浸润的影响。通过比色法测定MPO活性，以评估LPS攻击后6 h和24 h中性粒细胞浸润（A）和（B）。MPO活性以每克样品的单位表示。数据表示为平均值±标准偏差（n=6）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比，P＜0.05；$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；髓过氧化物酶；脂多糖；急性呼吸窘迫综合征；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图7
图7
cDC操作对Th1/Th2反应平衡的影响。通过逆转录定量PCR和western blotting检测T-bet和GATA-3的mRNA和蛋白表达水平，以评估Th1/Th2反应的平衡。（A） T-bet和（B）GATA-3的mRNA表达。β-actin作为参考基因。（C） T-bet和GATA-3蛋白表达的western印迹分析的代表性印迹。（D） T-bet和（E）GATA-3的蛋白表达水平。β-actin作为参考蛋白。数据表示为平均值±标准偏差（n=3）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比P<0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；Th、T辅助细胞；T-bet，T-box-expressed-in-T-cells；GATA-3、GATA结合蛋白3；急性呼吸窘迫综合征；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图8
图8
cDC操作对Th1/Th2细胞因子产生的影响。（A） 在LPS攻击后24小时，采用ELISA法测定肺部IFN-γ、（B）IL-1β、（C）IL-4和（D）IL-10的水平，以评估Th1/Th2细胞因子的产生。数据表示为平均值±标准偏差（n=6）。*与对照组相比P<0.05；#与ARDS相比P<0.05；&与FLT3L+ARDS相比P<0.05；和$与莱斯陶替尼+ARDS相比，P<0.05。cDC，经典树突状细胞；Th、T辅助细胞；干扰素、干扰素；白细胞介素；脂多糖；急性呼吸窘迫综合征；FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体。
图9
图9
FLT3L在正常和ARDS肺组织中的表达。在LPS攻击后6小时，通过western blotting评估正常和ARDS肺组织中FLT3L蛋白的表达水平。数据以平均值±标准差（n=3）表示。*与对照组相比，P<0.05。FLT3L，Fms样酪氨酸激酶3-配体；ARDS，急性呼吸窘迫综合征。
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