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.2019年6月4日；27（10）：2837-2846e4。
doi:10.1016/j.celrep.2019.05.029。

肿瘤发生过程中免疫细胞对基底膜区的蛋白水解和机会性破坏

Maaike C W van den Berg公司 1, 露西·麦卡锡-莫罗 2, 黛博拉·卡特 2, 约瑟芬·莫里斯 2, 伊莎贝尔·里贝罗·布拉沃 三, 一峰 4, 保罗·马丁 5
附属公司

肿瘤发生过程中免疫细胞对基底膜区的蛋白水解和机会性破坏

Maaike C W van den Berg公司等。 单元格代表. .

摘要

癌症相关炎症对癌症的发展和进展有显著影响。从早期开始，中性粒细胞和巨噬细胞被吸引到表皮的癌前细胞，但在直接相互作用之前，它们必须首先突破包括基底膜在内的底层细胞外基质屏障层。利用几种不同的皮肤癌模型和一个胶原蛋白I-GFP转基因斑马鱼系，我们进行了相关的光学和电子显微镜（CLEM）来捕捉免疫细胞穿越基底膜的瞬间。我们证明了活性蛋白水解酶挖洞和基质层中预先存在的弱点的机会主义使用。我们发现，这些小孔，以及基质屏障中更大的癌细胞生成或创伤触发的缝隙，为免疫细胞进入表皮癌细胞提供了入口，从而限制了癌症进展的速度。

关键词：CLEM；基膜带；癌症；细胞运动；胶原蛋白；炎症；巨噬细胞；中性粒细胞；斑马鱼。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
斑马鱼皮肤癌模型和免疫细胞招募（A）WT 3 dpf幼虫皮肤：浅层细胞层（A中为深灰色，A′和A〃中为GFP[绿色]）和基底细胞层（B中为浅灰色，A〃为洋红）和基底膜（BM）。（A〃′）扫描电镜显示表皮中有杯状细胞（A和A〃〃′中的箭头，B中的绿色）。（B） kita：RAS模型。在7 dpf幼虫中HRASG12V-GFP表达的杯状细胞过度增殖（B、B′和B〃为绿色）。基底细胞呈洋红色（B〃）。扫描电镜观察杯状细胞的轨迹（B〃′）。（C和D）K4:RAS和K19:RAS模型。HRASG12V-GFP在浅表（C和C′）或基底（72 hpi）（D和D′）肿瘤前细胞中的表达（4OHT诱导后48小时[hpi]）显示为绿色。（C） 在3 dpf幼虫（星号，C〃）和扫描电子显微镜（72 hpi）（C〃′）中表达HRASG12V GFP的浅表克隆（基底细胞显示为品红色）。（D） 5 dpf幼虫中HRASG12V-GFP表达的基础克隆（浅层细胞为洋红色）（D〃中的星号和D〃′中的扫描电镜）。（E–H）与对照组GAP-43 GFP表达相比，皮肤细胞中致癌HRASG12V的嵌合表达导致中性粒细胞（品红；E）和巨噬细胞（红色；F）的招募分别以（G）和（H）量化。另请参见图S1。（一） 中性粒细胞和巨噬细胞（使用PU.1和粒细胞集落刺激因子[GCSF]MO）的敲除抑制48 hpi幼虫的浅表癌前细胞生长（GFP）。比例尺：100μm（A′，A〃，B′，B〃，C′，C〃，D′，D〃，E，F，I）；20μm（A〃′、B〃′，C〃′和D〃′）。图表显示平均值±SEM。
图2
图2
5dpf WT幼虫皮肤表皮免疫细胞的相关光镜和电镜研究；浅表表皮层（乌贼墨）、下面的基底层和基膜，可见一条细的深色线（箭头）和杯状细胞。（ii）kita的TEM:RAS克隆（16 dpf），以及5 dpf（72 hpi）幼虫的表面克隆（iii）和基础克隆（iv），显示克隆内的免疫细胞（假红色）。（Bi）BMZ幼虫TEM。红色箭头表示基底膜；白色条表示I型胶原，E是上面的表皮，D是BMZ下面的真皮。（ii和iii）CLEM；共焦图像（ii，左下）和亚甲基蓝染色部分（ii，右）显示克隆和免疫细胞相互作用发生在泄殖腔附近的地方（黄色方框）（ii中的箭头）。（iii）10 dpf幼虫杯状细胞克隆（见插图）下方BMZ（绿色）中的粒细胞（红色）裂口。（C） 在5 dpf（72 hpi）幼虫中，肿瘤前表面细胞克隆下的BM（箭头）下方围绕成束的I型胶原（星号）的中性粒细胞（红色）突起（在插入的BM区域中为绿色）。（Di）含有胶原蛋白的巨噬细胞（红色）跨越5 dpf（72 hpi）幼虫基底细胞克隆下方BM（绿色）的缺口。（ii）对应于红色插图中黄色方框的高放大视图，而黄色方框又对应于（i）中的红色方框。红色箭头表示胶原纤维。（E） 5 dpf/48 hpi幼虫的共焦成像显示，I型胶原层（绿色）上方有一个巨噬细胞（红色，见白色箭头）靠近两个癌前基底细胞（红色，见图白色星号）。（F） 5 dpf（48 hpi）幼虫胶原蛋白I-GFP层中含有吞噬胶原蛋白（黄色）的巨噬细胞（白色箭头）的共焦成像。插图：单个z堆栈显示巨噬细胞内的胶原蛋白I-GFP（黄色）。（G） 延时视频（右上角的几分钟）的静像显示，一个巨噬细胞（红色）挤过胶原蛋白I层（绿色）中预先存在的一个洞，靠近5 dpf（72 hpi）幼虫左侧的一个浅表的癌前克隆（红色，白色虚线圆圈）。另请参阅视频S1。比例尺：5μm（Ai–Aiv、Biii和C[插入]、Di和G[视频静止]）；500纳米（C）；100 nm（Dii）；1μm（Dii[插入]和Biii）；10μm（E和F）；20微米（G）；500纳米（铋）；和100μm（Bii）。
图3
图3
BM屏障层中的弱点允许免疫细胞机缘性地穿过表皮（A）3dpf幼虫中的去猝灭异硫氰酸荧光素（FITC）-明胶表明巨噬细胞前缘的MMP活性（绿色或黄色）（红色；i和ii）。GM6001抑制整个体节的MMP活性（iv与iii）。（B） GM6001抑制中性粒细胞向尾鳍伤口的募集，但不抑制3 dpf（24 hpi）幼虫（C）肿瘤前细胞的中性粒细胞（品红色）或巨噬细胞（红色）募集。另请参见图S2A和S2B。（D） 在野生型5 dpf幼虫皮肤中，中性粒细胞和巨噬细胞优先沿着水平肌隔（箭头所示）移动。另请参见图S2C和S2D。（E） 沿着5dpf幼虫水平肌隔的胶原蛋白显示出结构改变、间隙或弱点（i和ii）。高倍镜显示了水平肌间隔（iii，白色箭头）上间隙大小的变化。另请参见图S2E。（Fi）表皮（E）-真皮（D）界面（a）的I型胶原（绿色）和IV型胶原（红色）的免疫染色显示，沿着5 dpf幼虫的水平肌间隔，IV型胶原和I型胶原中存在伴随的孔洞。（ii）5 dpf WT幼虫皮肤的TEM显示水平肌隔处BMZ有一个缺口（a中的黄色箭头）。红色箭头表示BM间隙的边缘；黑色箭头定义了同一位置（b）受损胶原蛋白I的边缘。（G） 巨噬细胞（红色，14dpf）和中性粒细胞（品红，5dpf）在I型胶原纤维“轨迹”（灰色）附近爬行。（H） 3 dpf幼虫侧面中性粒细胞和巨噬细胞的示意图和定量。（一） 视频中的静止序列显示，5 dpf幼虫的中性粒细胞（洋红）沿着肌间隔（箭头）处突出的I型胶原纤维（灰色）迁移。另请参阅视频S2。（J） 中性粒细胞（洋红）挤压（箭头）通过幼虫肌间隔处的I型胶原14 dpf。比例尺：10μm（Ai、Aii、Fib和Fic）；20μm（Aiii、Aiv、Ei、Eii、G和J）；5μm（Eii、Fia和Fiia）；50微米（B、C、D和I）；400 nm（Fiib）。图表显示平均值±SEM。
图4
图4
免疫细胞通过基底膜（A）中的入口沿着水平肌隔接触中性粒细胞和癌前细胞（星号），与侧翼其他部位的8 hpi相比，在3小时内接触表皮克隆。（B） 与更远的克隆（箭头）相比，克隆（星号）沿着水平肌间隔增殖。（C） 对照组的EDU染色示例，18 hpi时GFPCAAX表达的基底细胞（左）与GFP表达的HRASG12V基底细胞（右）。所示区域中双EDU（红色）和GFP+ve细胞的定量：A、B和C。（D–G）晚期癌前细胞克隆下BMZ的降解。（Di）在I-GFP胶原蛋白上的表面HRASG12V表达克隆（红色），在幼虫6 dpf（96 hpi）的克隆（白色虚线圆圈，Dii）正下方的胶原蛋白I层中有孔。（E） 5 dpf（96 hpi；Eii中的白色虚线）幼虫中表达HRASG12V的大表面克隆（红色）下方的胶原I-GFP降解区。肿瘤前细胞内的I型胶原团块轮廓（红色虚线）。（Fi）沿（Ei）中虚线A的克隆体横向3D视图。肿瘤前细胞内的GFP胶原I（星号和Fi中的插图）。另请参见图S3A和S3B。沿着（Ei）中的虚线B的克隆的3D视图显示克隆通过（Fii）中的胶原I-GFP层侵入。（G） TEM显示，在6 dpf幼虫中，表达HRASG12V的大型表面细胞克隆（120 hpi）下方的BMZ降解（白色箭头）。另请参见图S3C。（H） 伤后2天，一只7 dpf幼虫侧面伤口的最大投影共焦图像显示I-GFP胶原层和招募的巨噬细胞（红色）有缺陷。3D投影显示基质破裂下方和上方的巨噬细胞（红色）。（一） CLEM显示BMZ（绿色）出现缺口（箭头），免疫细胞（紫色细胞核）侵入。（Ji）中性粒细胞（洋红色）逃离伤口（箭头），在I型胶原层上向肿瘤前表面克隆（虚线圈）爬行，如（Jii）中中性粒细胞轨迹所示。另请参见图S4。比例尺：50μm（A–C、H和J）；10μm（D和I）；30μm（E）；1μm（G），5μm（插入G）。图表显示平均值±SEM。
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