The ORC ubiquitin ligase OBI1 promotes DNA replication origin firing

doi:10.1038/s41467-019-10321-x

.2019年6月3日；10(1):2426.

doi:10.1038/s41467-019-10321-x。

ORC泛素连接酶OBI1促进DNA复制源激活

菲利普·库伦¹, 乔尔·纳赛尔², 伊莎贝拉·佩弗², 斯拉维卡·斯坦诺希奇^三, 伊冯·斯特克斯^三 4, 阿克塞尔·德拉马尔², 圣埃芬·博奎特², 马塞尔·梅查利⁵

附属公司

¹人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。philippe.coulombe@igh.cnrs.fr。
²人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。
^三CNRS 5290-IRD 224-蒙彼利埃大学（UMR“MiVEGEC”），34090，法国蒙彼利埃。
⁴大学医院中心（CHU），寄生虫学-真菌学系，34090，法国蒙彼利埃。
⁵人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。marcel.mechali@igh.cnrs.fr。

采购管理信息： 31160578
预防性维修识别码：第547688页
内政部： 10.1038/s41467-019-10321-x

ORC泛素连接酶OBI1促进DNA复制源激活

菲利普·库伦等。国家公社. 2019.

.2019年6月3日；10(1):2426.

doi:10.1038/s41467-019-10321-x。

作者

附属公司

¹人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。philippe.coulombe@igh.cnrs.fr。
²人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。
^三CNRS 5290-IRD 224-蒙彼利埃大学（UMR“MiVEGEC”），34090，法国蒙彼利耶。
⁴大学医院中心（CHU），寄生虫学-真菌学系，34090，法国蒙彼利埃。
⁵人类遗传学研究所，UMR 9002，CNRS-蒙彼利埃大学，141 rue de la Cardonille，34396，Montpellier，France。marcel.mechali@igh.cnrs.fr。

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摘要

DNA复制启动是一个两步过程。在细胞周期的G1期，ORC复合体、CDC6、CDT1和MCM2-7在复制起源处聚集，形成复制前复合体（pre-RC）。在S期，激酶活性允许通过（CDC45/MCM2-7/GINS）CMG复合物的形成建立分支。然而，通过一种鲜为人知的选择机制，所有潜在起源中只有一个子集被激活。在这里，我们分析了人类细胞中的前RC蛋白质组相互作用组，发现C13ORF7/RNF219（以下简称OBI1，用于ORC-泛素连接酶-1）与ORC复合体相关。OBI1沉默会导致源发射缺陷，如CMG形成减少所示，但不会影响预RC建立。OBI1在S期催化染色质结合ORC3和ORC5子集的多单-双喹啉化。重要的是，非泛素化ORC3/5突变体的表达损害了起源激活，证明了它们作为OBI1底物与起源激活的相关性。我们的结果确定了参与起源激活的泛素信号通路，并提供了一个候选蛋白来选择要激活的起源。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
前RC相互作用组分析确定OBI1（C13ORF7/RNF219）为ORC相关蛋白。一所示毒饵是从稳定表达HeLa S3细胞系的Dignam核提取物中纯化的TAP-TAG。然后，20%的最终洗脱液在梯度丙烯酰胺凝胶上溶解，并通过银染色进行可视化。星号标记Flag-HA标记的诱饵。分子量标记以kDa表示。b条人类前RC相互作用体的示意图。本研究中使用的诱饵标记为红色。已知的前RC相互作用物以不同的颜色突出显示，而新型粘合剂以浅蓝色突出显示。OBI1（C13ORF7/RNF219）以黑色突出显示。交互程序根据其已知的交互进行分组。**c（c）**使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹法分析TAP-TAG最终洗脱液。d日人类OBI1的示意图，突出显示了环、线圈和C端子域。**e（电子）**免疫沉淀/免疫印迹分析证实了HeLa S3细胞Dignam提取物中内源性OBI1和ORC1的相关性。**（f）**OBI1表达和染色质结合的细胞周期调控。指数生长的U2OS细胞（Exp）通过与诺卡唑孵育在有丝分裂中同步，然后在正常生长培养基中释放指定时间。用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹分析可溶性和染色质组分。通过流式细胞术（下部面板）评估同步化。星号标记非特定带

图2
启动复制源时需要OBI1。一OBI1参与细胞增殖。用靶向OBI1 3′UTR（siUTR）或编码序列（siOBI1）、ORC1（siORC1）、CDC7（siCDC7）或非靶向siRNA（siMock）的siRNA池转染U2OS细胞（序列见补充表3）。转染后每天通过计数细胞来评估细胞增殖（相对于第0天增加的倍数）。给出了三个独立实验的平均结果。在第3天（右侧）通过western blotting监测内源性OBI1、ORC1、CDC7和PCNA的表达。b条U2OS细胞用siRNA转染，如一.转染后三天，细胞与BrdU孵育15 通过流式细胞术分析最小BrdU掺入量和DNA含量（左面板）。显示了划定BrdU-阳性siMock处理细胞的线。BrdU掺入荧光信号通过三个独立实验进行量化（右侧面板）。**c（c）**U2OS细胞用siRNA转染，如一.转染后三天，用IdU培养细胞（20 min），然后是CldU（20 min）并进行DNA梳理分析（见方法）。显示了双向叉标签的代表性图像。d日分析中描述的单元格中的复制分叉速度（以kb/min为单位）**c（c）**基于IdU信号之前的CldU轨迹测量（两个独立实验）。红色条表示中值。**e（电子）**中所述细胞的原生质体间距（kb）**c（c）**通过两个独立的实验进行量化。红色条表示中值。**（f）**中描述的单元格中的平均全局叉密度（以叉/Mb为单位）**c（c）**通过测量每兆基梳理DNA的标记叉数进行量化，并将其归一化为S期细胞的百分比（两个独立实验）。克用siRNAs转染U2OS细胞一三天后，分离染色质和可溶性部分，并用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹分析*第页 < 0.01; **第页 < 0.001

图3
染色质结合的ORC3和ORC5在S相中进行多单-双喹啉化。一U2OS细胞与指示的Myc-Flag（MF）标记的ORC亚基和HA标记的泛素共同转染。转染后两天，在含有NEM的裂解缓冲液中裂解细胞，并通过反标记免疫沉淀纯化标记蛋白。如图所示，免疫沉淀物的表达和泛素结合通过western blotting监测。b条U2OS细胞与指示的His联合转染₆-标记有标记的ORC亚单位和HA标记的泛素。分离染色质（C）和可溶性（S）组分，并在变性条件下用镍珠（Ni-NTA）纯化ORC亚基。纯化的蛋白质和输入提取物用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹分析。**c（c）**U2OS细胞与His联合转染₆-标记ORC5（HF-ORC5）和指示的HA标记泛素单赖氨酸（K）突变体。在0中 K突变体，所有赖氨酸残基都被精氨酸残余物取代。在镍珠（Ni-NTA）变性条件下纯化，检测ORC5泛素化。western blotting检测分离蛋白的表达和泛素结合。d日泛素化ORC5的UbiCRest分析。U2OS细胞用Myc-Flag（MF）标记的ORC5转染，没有异位泛素。转染后两天，对MF-ORC5进行免疫沉淀（IP:Flag），并与指示的氘化酶（DUBs）孵育。收集上清液并进行银染分析。显示DUB和释放的内源性泛素。通过对标记的ORC亚基进行western blotting检测到的高分子量形式的存在，揭示了泛素化。指出了所用DUB的泛素连接特异性。**e（电子）**稳定表达Myc-Flag（MF）标记的ORC3或ORC5的U2OS细胞通过与诺克唑孵育在有丝分裂中同步，然后在正常生长介质中释放指定时间。标记的蛋白质被免疫沉淀（IP:Flag），泛素化被抗Myc抗体评估（上部面板）。通过流式细胞术评估同步性（下部面板）

图4
OBI1催化ORC3和ORC5多单-泛素化。一U2OS细胞与指示的Myc-Flag（MF）标记的ORC亚基和HA标记的泛素共同转染。如有指示( + ), Myc-tagged OBI1也同时表达。转染后两天，在含有NEM的裂解缓冲液中裂解细胞，并通过反标记免疫沉淀纯化标记蛋白。如图所示，免疫沉淀物的表达和泛素结合通过western blotting监测。在输入提取物中也分析了Myc-OBI1的表达。b条, **c（c）**U2OS细胞与His共转染₆-标志ORC3（HF-ORC3）或他的₆-如图所示，标记物ORC5（HF-ORC5）和野生型（WT）或非活性（CS）Myc-OBI1以及HA-ubiquitin。在镍珠（Ni-NTA）变性条件下纯化，检测ORC3/5泛素化。western blotting检测分离蛋白的表达和泛素结合。在输入提取物中也分析了Myc-OBI1的表达。d日,**e（电子）**U2OS细胞转染Mock或*OBI1公司*-特异性siRNAs。第二天，如图所示，用Myc-Flag（MF）标记的ORC3或ORC5和HA标记的泛素共同转染细胞。2天后检测到泛素化，如一通过western blotting监测输入提取物中内源性OBI1的表达。**（f）**,克OBI1体外试验。用野生型Flag-OBI1（WT）或非活性突变体（CS）转染U2OS细胞两天。免疫沉淀OBI1（IP:Flag）与体外翻译的Myc-ORC3或-ORC5以及E1、E2（UbcH5a）、泛素和ATP孵育30小时 37时的最小值摄氏度。如图所示，通过western blotting检测标记蛋白。小时OBI1体外试验按**（f）**,克，但具有野生型（WT）或赖氨酸较少（0 K）泛素。如图所示，通过western blotting检测标记蛋白

图5
ORC3和ORC5多单-泛素化对起源激发至关重要。一U2OS细胞与His联合转染₆-标记野生型（WT）ORC3和ORC5或无赖氨酸版本（0 K、参见补充图10a）和HA-ubiquitin，如图所示。转染后两天，细胞在变性条件下进行溶血，以检测His₆-标记蛋白纯化。western blotting检测分离蛋白的表达和泛素结合。b条U2OS细胞与Myc-tagged（WT或0 K） ORC3和ORC5或EGFP和标志ORC2。转染两天后，对细胞裂解物进行标记免疫沉淀以纯化ORC亚单位，并通过western blotting分析共表达蛋白的相关性。此外，还监测了输入提取物中Myc-tagged蛋白的表达。**c（c）**用ORC3和ORC5（WT或0）转染U2OS细胞 K）、Myc-精氨酸或空载体，并带有嘌呤霉素耐药质粒。第二天，在嘌呤霉素培养基中选择转染细胞2天，然后在没有选择的情况下再生长一天。然后用BrdU对细胞进行脉冲15 min，并通过流式细胞仪进行分析（上部面板）。BrdU掺入荧光信号通过三个独立实验（左下面板）进行量化。通过western blotting（右下角）评估异位蛋白和内源性PCNA的表达。ns，不显著*第页 < 0.01.d日U2OS细胞按**c（c）**通过免疫印迹法分离染色质和可溶性组分，并使用针对所示蛋白质的抗体进行分析。**e（电子）**DNA纤维拉伸分析。U2OS细胞按**c（c）**用IdU培养细胞（15 最小值；红色），然后是CldU（15 最小值；绿色）并进行DNA扩散处理。显示了具有代表性的图像。比例尺，5 微米。测量IdU信号后CldU轨道的长度。两个独立的实验显示了200多个测量值。红色条表示中值。ns，不显著*第页 < 0.01

图6
OBI1在DNA复制起源激活中的拟议作用。一在细胞周期的G1期，潜在的起源独立于OBI1的作用而被许可，导致复制解旋酶MCM2/7的染色质募集处于非活性状态。在S相，OBI1催化原始结合ORC复合物的多单-双奎坦化，这是一种促进原始激发的修饰。b条OBI1可以通过ORC3和ORC5的多单-泛素化标记，在G1许可的所有潜在来源中选择要在S期激活的来源。OBI1-选择的起源池可能因细胞而异，这解释了哺乳动物起源的燃烧效率相对较低。ORC复合物的这种修饰可以通过招募假定的泛素结合激活因子发挥作用，或者通过打开局部染色质环境，使其更容易受到限制性激发因子的影响

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